抗前列腺癌單鏈抗體介導(dǎo)的靶向siRNA抑制Notch1基因抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌是男性發(fā)病率第二位的惡性腫瘤,我國前列腺癌發(fā)病率也逐年升高,其發(fā)病增長率已居泌尿生殖系腫瘤之首。前列腺癌具有潛伏性長、發(fā)病率高的特點(diǎn)。在我國70歲以上男性人群中,高達(dá)25％的人患有前列腺癌。但臨床上前列腺癌早期診斷率低,因而多數(shù)患者失去了早期手術(shù)根治的機(jī)會。
　　通過siRNA下調(diào)Notch1基因可以有效抑制人類前列腺癌細(xì)胞的生長。然而如何靶向輸送siRNA進(jìn)入特定細(xì)胞是臨床應(yīng)用此技術(shù)的主要障礙。最近有研究表明,單鏈抗體介

2、導(dǎo)的靶向輸送系統(tǒng)是高效下調(diào)相應(yīng)基因的有效方法。為了解決RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)應(yīng)用缺乏靶向性的難題,我們擬通過抗前列腺癌單鏈抗體的融合基因,并予以優(yōu)化,進(jìn)行表達(dá)、純化后獲得融合蛋白scFv-Fdt-HA2-tp(sFH-tP),構(gòu)建成siRNA靶向輸送系統(tǒng)。利用FITC-siRNA在體內(nèi)外驗(yàn)證這一系統(tǒng)的有效性;隨后驗(yàn)證靶向輸送的針對Notch1基因抑制效果最佳的siRNA在體內(nèi)外對前列腺癌細(xì)胞生長的抑制作用。利用這一靶向輸送系統(tǒng)不但能克服s

3、iRNA在體內(nèi)輸送效率低下,還避免siRNA大量應(yīng)用時所產(chǎn)生的“脫靶”效應(yīng)、非特異性免疫反應(yīng)等問題,實(shí)現(xiàn)對腫瘤生長的高效抑制,為RNA干擾技術(shù)在前列腺癌的臨床治療中的應(yīng)用提供理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前前列腺特異性膜抗原(PSMA)被認(rèn)為是一個較明確的前列腺抗原。
　　我們的前期研究工作表明Notch信號通路中的Notch1在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,應(yīng)用siRNA抑制前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Notch1基因的表達(dá),引起細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞

4、凋亡,表明腫瘤細(xì)胞的生長受到有效的抑制,因此通過siRNA抑制Notch1基因有望成為一種有效的針對前列腺癌的基因治療方法。但由于缺乏有效的靶向給藥輸送系統(tǒng),常常出現(xiàn)藥物的“脫靶”現(xiàn)象,限制了此技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。本課題是在獲得高親和力的特異性抗前列腺癌單鏈抗體(scFv)的基礎(chǔ)上,擬將其與不同的基因片段融合并予以優(yōu)化,構(gòu)建成融合蛋白。使單鏈抗體介導(dǎo)的靶向輸送系統(tǒng)與特異性的siRNA結(jié)合后,在抗體的介導(dǎo)下到達(dá)靶細(xì)胞,隨抗體內(nèi)化入細(xì)胞到達(dá)靶

5、點(diǎn),從而高效抑制Notch1基因的表達(dá)。利用抗體介導(dǎo)siRNA可以特異性的到達(dá)腫瘤部位,從而實(shí)現(xiàn)特異、高效的抗腫瘤作用,同時避免siRNA大量應(yīng)用時所產(chǎn)生的“脫靶”效應(yīng),此策略將為RNAi技術(shù)在腫瘤研究、治療中的應(yīng)用開辟新途徑。
　　本研究的目的是評估單鏈抗體及兩種融合蛋白是否可以有效的將特異性siRNA輸送到PSMA陽性的前列腺癌細(xì)胞內(nèi)。融合蛋白由抗PSMA單鏈抗體(scFv)、魚精蛋白截短體(tp)構(gòu)成。將弗林蛋白酶(Furi

6、n)、流感病毒的融合肽(HA2)片段序列插入到單鏈抗體及魚精蛋白截短體之間構(gòu)成另一融合蛋白。我們的結(jié)果表明,siRNA能夠被融合蛋白特異性的輸送到PSMA陽性的前列腺癌細(xì)胞內(nèi),sFH-tP融合蛋白效果更明顯。應(yīng)用前列腺癌細(xì)胞系及前列腺癌荷瘤裸鼠模型,驗(yàn)證靶向輸送系統(tǒng)引導(dǎo)下siRNA是否能夠在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對Notch1的高效抑制,實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。進(jìn)一步的研究證實(shí)了siNotch1融合蛋白可以在體內(nèi)及體外有效地抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。本研究成果