siRNA沉默前列腺癌細(xì)胞PC-3中A20基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌( Prostate Cancer )是歐美國家常見的惡性腫瘤，占男性癌癥死亡人數(shù)第二位。我國前列腺癌發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于歐美國家，但近年來也逐年增高，已列為男性泌尿系腫瘤的第三位。前列腺癌對(duì)人類健康的威脅變得越來越嚴(yán)重。人們?cè)谥匾晜鹘y(tǒng)的手術(shù)治療，激素治療，放、化療等治療手段的同時(shí)，也在尋找新的治療方法。 二十世紀(jì)九十年代基因治療的興起，開辟了腫瘤治療的新途徑。目前，已有多種基因治療方案得到初步應(yīng)用，同時(shí)研究人員仍在不斷尋找新

2、的治療基因。A20，最初在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是腫瘤壞死因子α( TNF-α) 可誘導(dǎo)的初級(jí)應(yīng)答基因。隨后人們克隆了A20 基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物為一種鋅指蛋白。在人類乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞瘤WEHI164 細(xì)胞、鼠胚胎成纖維NIH3T3 細(xì)胞、胰島β細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，A20 穩(wěn)定地高表達(dá)能夠抑制TNF 誘導(dǎo)的凋亡。 但是在人肝癌HepG2 細(xì)胞，肺上皮A549 細(xì)胞，人宮頸癌Hala 細(xì)胞

3、中，刺激因子刺激后A20 并未呈現(xiàn)出高表達(dá)，因而認(rèn)為A20 不具有保護(hù)這些細(xì)胞的能力。一些細(xì)胞系受到A20 的保護(hù)而另一些細(xì)胞未能受到保護(hù)的原因還不清楚。目前有關(guān)A20 與腫瘤關(guān)系的研究還很少。 RNA 干擾( RNA interference，RNAi ) 指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA 編碼區(qū)同源的雙鏈RNA ( double stranded RNA，dsRNA )時(shí)，該mRNA 發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象

4、發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默( post transcriptional gene silencing，PTGS )。 目前，RNAi 以其特有的高效性和特異性而廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療的科學(xué)研究中。 本研究首先通過RT-PCR ( reverse transcription-polymerase chainreaction )和Western blot 技術(shù)檢測(cè)了人前列腺癌細(xì)胞PC-3、PC-3M、DU1

5、45、Lncap 和22RV1 中A20 mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，五種人前列腺癌細(xì)胞系中均有A20 的表達(dá)，其中PC-3 和PC-3M 中mRNA 和蛋白水平較高，22RV1 中較低(p<0.01)。因此，A20 在PC-3 細(xì)胞中的高表達(dá)為下一步進(jìn)行的RNAi 實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞模型的選擇奠定了基礎(chǔ)。 根據(jù)A20 基因序列和siRNA 設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成了三對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸

6、片斷。經(jīng)變性、退火后形成三個(gè)能表達(dá)小發(fā)夾RNA ( small hairpinRNA，ShRNA)的DNA片斷。每個(gè)DNA片斷分別與pSilencer3.1-H1 hygro載體連接，得到RNA 聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子H1 啟動(dòng)的重組siRNA 表達(dá)載體pSilencer3.1-A1，pSilencer3.1-A2 和pSilencer3.1-A3，重組siRNA 表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定和DNA 序列測(cè)定后，轉(zhuǎn)染PC-3 細(xì)胞，潮霉素進(jìn)行穩(wěn)定克隆

7、篩選。用RT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測(cè)了A20 的表達(dá)水平變化，用流式細(xì)胞儀、MTT 法檢測(cè)了A20 基因表達(dá)沉默后，PC-3 細(xì)胞的抗凋亡能力，分化、增殖能力的變化。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC 轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞相比，重組質(zhì)粒pSilencer3.1-A1 和pSilencer3.1-A3 有效的阻斷了A20 的表達(dá)，而重組質(zhì)粒pSilencer

8、3.1-A2 轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞中A20 表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化；與未轉(zhuǎn)染組和pSilencer3.1-NC 轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞相比，pSilencer3.1-A1 和pSilencer3.1-A3 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的凋亡率分別增加了11.9％和7.7％，而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞周期沒有明顯的變化。 本研究初步證明了A20 基因在人前列腺癌PC-3 細(xì)胞中高表達(dá)且具有抗凋亡作用，為進(jìn)一步證實(shí)A20 是否能成為前列腺癌基因治療的