HER2單鏈抗體可變區(qū)表達(dá)與純化及抑制腫瘤細(xì)胞T6-17增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建 HER2-scFv表達(dá)載體，體外純化獲得 HER2-scFv蛋白，進(jìn)而探討HER2-scFv抑制高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞系T6-17增殖，為下一步抗腫瘤研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：①根據(jù)已有質(zhì)粒pUC57-HER2-scFv為模板設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)獲取目的基因 HER2-scFv。②運(yùn)用雙酶切及分子克隆等技術(shù)將目的基因片段克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a，構(gòu)建 pET28a-HER2-scFv重組質(zhì)粒。③重組質(zhì)

2、粒pET28a-HER2-scFv轉(zhuǎn)化Rosetta大腸桿菌，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得HER2-scFv蛋白。④蛋白親和層析方法純化蛋白，進(jìn)而對(duì)包涵體蛋白復(fù)性。⑤SDS-PAGE及Western blot證實(shí)IPTG誘導(dǎo)HER2-scFv蛋白表達(dá)。⑥實(shí)驗(yàn)分為三組，分別為空白對(duì)照組，HER2-scFv組和曲妥珠單抗組。應(yīng)用MTT法研究HER2-scFv對(duì)HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞T6-17增殖的生長(zhǎng)抑制作用。
　　結(jié)果：①PCR技術(shù)成功獲

3、得HER2-scFv目的基因。②構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-HER2-scFv，經(jīng)鑒定證實(shí)插入序列方向大小正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功。SDS-PAGE和Western blot證實(shí)IPTG誘導(dǎo)pET28a-HER2-scFv轉(zhuǎn)化的Rosetta大腸桿菌表達(dá)HER2-scFv蛋白成功，大小約為29KDa。獲得包涵體蛋白并復(fù)性，濃度為1358.3mg/L，純度約為90％，一升菌液可獲得蛋白約10mg左右。③MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組結(jié)果顯示：HER

4、2-scFv組抑制HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞T6-17的抑制率為33.52%，與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P<0.05）；曲妥珠單抗組抑制HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞T6-17的抑制率為34.79%，與PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P<0.01）；而 HER2-scFv組與曲妥珠單抗組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.429，P>0.05）。
　　結(jié)論：①成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-HER2-scFv。②重組質(zhì)