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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:胃癌作為我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一,在WHO官方公布的2012年度統(tǒng)計(jì)中位列全國(guó)所有死亡原因的第6位,據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥登記中心的最新公布數(shù)據(jù)顯示,胃癌在男女兩性癌癥致死率排位中居第3位。由于早期診斷率偏低,我國(guó)的胃癌新發(fā)病例確診后多為進(jìn)展期胃癌,而在其治療上仍是以根治性手術(shù)輔以術(shù)后化療、放療等綜合治療手段為主。伴隨著免疫學(xué)和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展,近年來(lái)嵌合性抗原受體(CAR)T細(xì)胞治療作為過(guò)繼性免疫治療的一種新方法,在臨床治療部分
2、血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了成功,因而將其引入胃癌的免疫治療也成為一種新選擇。我們通過(guò)篩選胃癌細(xì)胞腫瘤相關(guān)抗原后,HER2作為其細(xì)胞膜表面抗原之一被用作CAR的靶抗原,引導(dǎo)T細(xì)胞直接和間接殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)通過(guò)基因改造的T細(xì)胞分泌hIL-12來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境,輔助誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子發(fā)揮免疫殺傷作用,從而有效抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。
目的:以實(shí)驗(yàn)室前期相關(guān)技術(shù)工作為基礎(chǔ),構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)HER2靶向性CAR和分泌hIL-12的慢
3、病毒骨架質(zhì)粒,通過(guò)三質(zhì)粒慢病毒體系制備病毒并轉(zhuǎn)染由人體外周血分離、培養(yǎng)的T細(xì)胞,將其回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi),觀察不同組合T細(xì)胞的抗腫瘤作用。
方法:1.構(gòu)建HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個(gè)基因序列,并將它們分別插入pVAX載體以構(gòu)建新質(zhì)粒,再分別感染293T細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR序列在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中hIL-12濃度。2個(gè)基因序列均送DNA測(cè)序驗(yàn)證完整性。
4、> 2.將HER2嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個(gè)基因序列分別插入pWPT-GFP載體以構(gòu)建慢病毒骨架質(zhì)粒,再將其與輔助包裝質(zhì)粒psPAX2、PMD2.G構(gòu)成三質(zhì)粒慢病毒體系制備病毒上清,再分別感染293T細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR序列在細(xì)胞膜的表達(dá),用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中hIL-12濃度。2個(gè)基因序列均送DNA測(cè)序驗(yàn)證完整性。
3.利用健康成人外周血分離、培養(yǎng)T細(xì)胞,利用前期成功構(gòu)建的三質(zhì)粒慢病毒體
5、系制備病毒上清,用其感染T細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR序列在細(xì)胞膜的表達(dá),用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中hIL-12濃度。
4.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同胃癌細(xì)胞系HER2表達(dá)情況,選擇不同表達(dá)強(qiáng)度的胃癌細(xì)胞系分別與CART細(xì)胞共培養(yǎng),用ELISA試劑盒檢測(cè)上清中IFN-γ、IL-2的濃度;用CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶釋放以評(píng)估CART細(xì)胞對(duì)HER2表達(dá)不同水平胃癌細(xì)胞的殺傷效果。
5.
6、選擇NCI-N87胃癌細(xì)胞以皮下注射的方式構(gòu)建小鼠胃癌模型,采用隨機(jī)分組方式分組后接受普通T細(xì)胞、CART細(xì)胞、CART細(xì)胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細(xì)胞回輸,觀察小鼠瘤體體積變化及有無(wú)不良反應(yīng),最后處死小鼠并記錄瘤體體積和重量。
結(jié)果:1.成功構(gòu)建了HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個(gè)基因序列,并將其構(gòu)建成pVAX-CAR、pVAX-hIL-12質(zhì)粒并進(jìn)行目的基因測(cè)序,將2種質(zhì)粒分別感染293T細(xì)胞后
7、,通過(guò)F(ab')2片段檢測(cè)CAR陽(yáng)性率可達(dá)到46.23%,通過(guò)CD3zeta片段檢測(cè)時(shí)有陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性率可達(dá)37.79%,血清中hIL-12濃度為40.95±1.19pg/ml。
2.成功構(gòu)建了pWPT-CAR、pWPT-hIL-12慢病毒骨架質(zhì)粒并進(jìn)行目的基因測(cè)序,分別與輔助包裝質(zhì)粒psPAX2、PMD2.G構(gòu)成三質(zhì)粒慢病毒體系割備病毒上清,成功地分別感染293T細(xì)胞,通過(guò)F(ab')2片段檢測(cè)pWPT-CAR病毒上清濃縮
8、液滴度1.78×108TU/ml,血清中hIL-12濃度最高可達(dá)100.80±9.02pg/ml。
3.檢測(cè)胃癌細(xì)胞系HER2表達(dá)結(jié)果顯示NCI-N87為強(qiáng)陽(yáng)性,AGS僅次于NCI-N87,SGC7901和MGC803為中等陽(yáng)性,MKN45和BGC823為弱陽(yáng)性。
4.從健康成人外周血中分離單核細(xì)胞后誘導(dǎo)增殖,CD3+細(xì)胞達(dá)到95%以上,用上述構(gòu)建的三質(zhì)粒慢病毒體系感染T細(xì)胞后,CD3+F(ab')2+淋巴細(xì)胞可占到
9、70%以上,細(xì)胞上清液中hIL-12濃度為56.59±7.48pg/ml。
5.制備的CART細(xì)胞可以識(shí)別HER2+胃癌細(xì)胞并產(chǎn)生直接殺傷作用,且隨著E/T升高而增強(qiáng),同時(shí)可檢測(cè)到大量細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2的釋放,對(duì)HER2-或低表達(dá)胃癌細(xì)胞則無(wú)此作用。
6.建立Balb/c-nu小鼠胃癌腫瘤模型成功后,觀察普通T細(xì)胞、CAR T細(xì)胞、CART細(xì)胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細(xì)胞回輸前后的小鼠移植瘤生長(zhǎng)變化,
10、證明CART細(xì)胞和CART細(xì)胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細(xì)胞治療組均可抑制腫瘤生長(zhǎng),普通T細(xì)胞治療組無(wú)法有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。小鼠回輸細(xì)胞后未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。
結(jié)論:本研究構(gòu)建HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因序列獲得成功,以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒、慢病毒骨架質(zhì)粒均可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染、表達(dá),構(gòu)建的三質(zhì)粒幔病毒體系可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外周血中分離培養(yǎng)的T細(xì)胞,體外實(shí)驗(yàn)中CAR T細(xì)胞可有效識(shí)別殺傷HER2+胃癌細(xì)胞,并
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