抗人EpCAM單鏈抗體的制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)是一種I型跨膜蛋白，分子量約為40kDa，在第八屆人類(lèi)白細(xì)胞分化抗原專(zhuān)題會(huì)議中，被命名為CD326。EpCAM的胞膜外區(qū)和胞漿區(qū)都具有重要功能。胞膜外區(qū)主要發(fā)揮黏附作用，參與細(xì)胞的增殖和遷移。其胞漿區(qū)可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)正常或腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白的生成，從而發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在正常情況下，人EpCAM僅表達(dá)于上皮組織；而在病理情況下，Ep

2、CAM在多種腫瘤和炎癥相關(guān)組織中表達(dá)。無(wú)論在胚胎發(fā)育和分化過(guò)程中，還是在正常情況下以及炎癥和腫瘤等病理?xiàng)l件下，EpCAM表達(dá)都會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)的變化。EpCAM表達(dá)的變化不但對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化等功能起著重要的作用，而且對(duì)不同腫瘤具有不同意義，其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致某些腫瘤的惡性程度增強(qiáng)，在另一些腫瘤中作用則可能相反。此外，EpCAM可以作為胚胎干細(xì)胞和某些實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一。根據(jù)不同的表達(dá)情況，EpCAM可能成為某些腫瘤診斷及判斷預(yù)后的

3、標(biāo)志物。EpCAM作為靶點(diǎn)在抗腫瘤治療中一直受到重視。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，針對(duì)EpCAM的腫瘤靶向治療方案不斷更新，從上世紀(jì)80年代最早應(yīng)用于臨床的鼠源性單抗，已發(fā)展到目前的單鏈抗體、嵌合抗體和完全人源抗體。其中，2009年Catumaxomab已經(jīng)在歐洲通過(guò)臨床試驗(yàn)和審查，開(kāi)始用于臨床腫瘤疾病的治療。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有EpCAM的治療性抗體的相關(guān)研究。
　　本文主要以EpCAM基因工程抗體的制備和應(yīng)用為主要研究?jī)?nèi)

4、容。首先，我們從抗EpCAM抗體中，篩選出5株（FMU-EpCAM-2A9、4E4、4A11、2D7和4F6）可與天然EpCAM分子結(jié)合的抗體作為構(gòu)建基因工程抗體的侯選親本抗體。從其中4株雜交瘤細(xì)胞系中，成功克隆出單抗FMU-EpCAM-2A9、4E4、2D7和4F6的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。選擇單抗FMU-EpCAM-2A9的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建了單鏈抗體原核表達(dá)載體GST-scFv2A9，表達(dá)并純化了GST-scFv2A9

5、融合蛋白。采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法證實(shí)了該融合蛋白具有與天然EpCAM分子以及原核重組表達(dá)的EpCAM分子結(jié)合的活性。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了免疫毒素原核表達(dá)載體即單鏈抗體(GST-scFv2A9)-綠膿桿菌外毒素PE(PE38KDLE)，簡(jiǎn)寫(xiě)為GST-scFv2A9-PE或GST-APE；表達(dá)、純化了免疫毒素融合蛋白GST-APE，切除GST標(biāo)簽，進(jìn)一步證實(shí)免疫毒素APE不僅可與天然EpCAM分子以及原核重組表達(dá)EpCAM分子相結(jié)合

6、，而且可在體外發(fā)揮殺傷表達(dá)EpCAM分子的肝癌細(xì)胞系HHCC細(xì)胞的作用。至此，我們采用分子生物學(xué)及免疫學(xué)方法制備并鑒定了針對(duì)EpCAM的基因工程抗體，為開(kāi)發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的針對(duì)EpCAM的治療性抗體打下重要的基礎(chǔ)。
　　此外，本研究分析了EpCAM分子的胞漿區(qū)Ep-ICD和胞膜區(qū)的EpEx，在不同組織學(xué)分型的胰腺癌組織中的表達(dá)分布規(guī)律。首次發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中EpCAM表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型有關(guān)。預(yù)后較差的低分化程度的腫瘤組織胞