雙功能RGD-TAT修飾的DNA納米膠束的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望，也是研究最為活躍的領(lǐng)域?；?qū)胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)?，F(xiàn)階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體，治療基因的導(dǎo)入仍然是腫瘤基因治療的瓶頸。非病毒載體近年來(lái)發(fā)展迅速，其中聚乙烯亞胺(polyethyleniminePEI)是近年來(lái)研究最為廣泛的陽(yáng)離子多聚物非病毒基因載體，然而，聚乙烯亞胺作為基因載體使用存在三個(gè)突出問(wèn)題：第一，轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性存在矛盾。小分子PEI雖細(xì)胞毒性低，但轉(zhuǎn)染效果差，高分

2、子量PEI雖具有較理想轉(zhuǎn)染效率，但細(xì)胞毒性強(qiáng)；第二，體液環(huán)境中穩(wěn)定性與穿膜能力存在矛盾。為增加復(fù)合物體液環(huán)境中的穩(wěn)定性，應(yīng)提高PEI/DNA復(fù)合物的親水性，但同時(shí)穿膜能力也因而受到影響，使轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著降低。第三，聚乙烯亞胺靶向性差，解決靶向性問(wèn)題已成為非病毒載體中最為關(guān)注的問(wèn)題。
　　 基于以上分析，本課題首先采用PluronicP123連接低分子量聚乙烯亞胺(PEI2000)，得到多分枝狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子量PEI衍生物，然后

3、利用整合素αvβ3在人多數(shù)腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管高表達(dá)的特點(diǎn)，選擇特異親和該整合素的RGD短肽，與細(xì)胞穿膜肽TAT(49-57)連接，合成具有靶向于αvβ3和促進(jìn)載體穿膜的含RGD和TAT(49-57)雙功能肽RGDC-TAT(命名為R13)，利用交聯(lián)技術(shù)將R13與PEI衍生物偶聯(lián)，從而構(gòu)建新型非病毒基因載體系統(tǒng)P123-PEI-R13，并考察該系統(tǒng)細(xì)胞穿膜及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放機(jī)制。本課題針對(duì)PEI作為基因載體使用中存在的問(wèn)題，旨在保證較高

4、轉(zhuǎn)染效率情況下，降低PEI細(xì)胞毒性，增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞及其新生血管的靶向性，進(jìn)而提高基因的細(xì)胞攝取水平和轉(zhuǎn)染效率，提高腫瘤的基因治療效果，為基因治療探索一條有效的途徑。
　　 本課題第一部分內(nèi)容是P123-PEI-R13合成與表征。首先采用固相法制備雙功能肽R13(RGDC-TAT)，并通過(guò)電噴霧質(zhì)譜分析鑒定其序列，通過(guò)HPLC測(cè)定其相對(duì)百分含量，通過(guò)表位肽標(biāo)記的HRP來(lái)檢測(cè)R13與整合素陽(yáng)性的Hela細(xì)胞與B16細(xì)胞的體外結(jié)合。

5、進(jìn)而采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化PluronicP123，并以其為反應(yīng)劑交聯(lián)PEI2KDa，得到高分子量PEI衍生物P123-PEI，再選擇SMCC法將R13按不同反應(yīng)比與P123-PEI偶聯(lián)，得到目的產(chǎn)物P123-PEI-R13，各反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)IR或1H-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，成功合成了雙功能肽R13，其序列為Arg-Gly-Asp-Cys-Arg-Lys-Lys-Aarg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RGDCRK

6、KRRQRRR)，純度為95.8677％，同時(shí)R13體外具有親和整合素αvβ3陽(yáng)性細(xì)胞的能力；成功采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化P123并交聯(lián)PEI2KDa，同時(shí)成功采用SMCC法將雙功能肽R13與P123-PEI偶聯(lián)，紅外、核磁等結(jié)構(gòu)表征表明目的產(chǎn)物修飾度高、純度好，表明所選合成方法穩(wěn)定、可控、重復(fù)性好。
　　 本課題第二部分內(nèi)容是P123-PEI-R13理化性質(zhì)。通過(guò)測(cè)定P123-PEI-R13在37℃下不同時(shí)間點(diǎn)分子量的方法

7、評(píng)價(jià)其水解性能，采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯分析考察其縮合DNA能力以及對(duì)質(zhì)粒DNA抗DNaseI、FBS和肝素鈉酶解及解離能力，利用透射電鏡觀察復(fù)合物形態(tài)，使用激光粒度儀和zeta電位儀測(cè)定粒徑、電位，采用MTT法評(píng)價(jià)合成的P123-PEI-R13對(duì)Hela細(xì)胞、B16細(xì)胞的毒性，并與PEI25kDa對(duì)照。結(jié)果表明，聚合物P123-PEI-R13在37℃可緩慢水解，大約60h左右可水解成小分子化合物，其水解過(guò)程可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程描述。P12

8、3-PEI-R13/DNA復(fù)合物呈近似球形的膠束樣結(jié)構(gòu)，粒徑在100-300nm之間，電位適中。P123-PEI-R13與DNA質(zhì)量比為2時(shí)能與DNA完全結(jié)合，同時(shí)可抵抗高達(dá)280μg/mL的肝素鈉、50％的FBS及6UDNaseI/DNA的解離或酶解。相比較PEI25kDa，P123-PEI-R13細(xì)胞毒性顯著降低。
　　 本課題第三部分內(nèi)容是P123-PEI-R13/DNA納米復(fù)合物體內(nèi)外轉(zhuǎn)染。以綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-

9、N2和蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒pGL3-control作為報(bào)告基因，評(píng)價(jià)其對(duì)Hela人宮頸癌細(xì)胞、B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞及HepG2人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力，采用流式細(xì)胞儀和發(fā)光儀測(cè)定綠色熒光蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蟲(chóng)熒光素酶活性，分別定性定量考察P123-PEI-R13對(duì)各受試細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)，構(gòu)建腫瘤模型，以蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒pGL3-Control作為報(bào)告基因，評(píng)價(jià)P123-PEI-R13遞送DNA時(shí)在體內(nèi)的分布與轉(zhuǎn)染效率。體外轉(zhuǎn)染試

10、驗(yàn)表明，在考察的w/w范圍內(nèi)，隨w/w比提高，轉(zhuǎn)染效率有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)；隨R13修飾比提高，轉(zhuǎn)染效率有逐漸下降趨勢(shì)；整體而言，P123-PEI-R13在各細(xì)胞轉(zhuǎn)染遠(yuǎn)好于PEI2KDa，也好于P123-PEI，比PEI25KDa略強(qiáng)或近似。體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，P123-PEI-R13在HepG2人肝癌移植模型與B16小鼠黑色素瘤移植模型轉(zhuǎn)染情況類似，整體轉(zhuǎn)染能力較P123-PEI與PEI25KDa強(qiáng)，同時(shí)也改善了復(fù)合物的體內(nèi)分布，并且由于R

11、13的修飾，使其在腫瘤組織轉(zhuǎn)染效率顯著提高，可知聚合物P123-PEI-R13在體內(nèi)有較強(qiáng)的腫瘤靶向能力，但與其對(duì)二種腫瘤細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染相比效率要低。
　　 本課題第四部分內(nèi)容是P123-PEI-R13/DNA納米復(fù)合物穿膜及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放機(jī)制的研究。本部分采用加入不同內(nèi)吞途徑抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)染效率是否產(chǎn)生影響的方法，考察復(fù)合物內(nèi)吞途徑；采用加入內(nèi)涵體.溶酶體酸化抑制劑、細(xì)胞骨架和動(dòng)力蛋白抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)染效率是否產(chǎn)生影響的方法，考察復(fù)合物

12、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；采用細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境是否影響復(fù)合物穩(wěn)定性的方法，考察復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的解離；采用熒光標(biāo)記聚合物并結(jié)合激光共聚焦顯微鏡考察復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)定位。結(jié)果表明，P123-PEI-R13修飾R13后，使其細(xì)胞攝取表現(xiàn)出了不同特性，P123-PEI-R13/DNA復(fù)合物可通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞及巨胞飲三條途徑內(nèi)吞入胞，并可能有不依賴能量的非內(nèi)吞途徑存在。P123-PEI-R13/DNA復(fù)合物入胞后首先經(jīng)內(nèi)涵

13、體-溶酶體系統(tǒng)酸化過(guò)程而從中逃逸，并以微管為軌道和方向，以動(dòng)力蛋白為動(dòng)力來(lái)源，在微絲作用下，并有中間纖維協(xié)助，向微管“-”端，即細(xì)胞核方向轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA與P123-PEI-R13具有更強(qiáng)親和性，P123-PEI-R13/DNA復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)被RNA解離，從而釋放DNA。
　　 本課題通過(guò)PluronicP123連接低分子量PEI制備高分子量PEI衍生物，并利用交聯(lián)技術(shù)將雙功能R13與該衍生物偶聯(lián)，研制新型具有主動(dòng)靶向αvβ3作用