RGD-FasL的基因構(gòu)建、表達(dá)、純化及功能分析.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的頭號殺手,手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的常用方法。放療、化療因同時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞,副作用大,因此尋找特異、高效的腫瘤治療方法一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。肝癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤,肝癌是所有腫瘤中的第二位致死因素,肝癌的治療方法及效果對肝癌防治致關(guān)重要,近年來,隨著肝癌的發(fā)病機(jī)理和治療研究的進(jìn)展,人們認(rèn)識到細(xì)胞凋亡機(jī)制的異常在肝癌發(fā)生和抗腫瘤治療中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn)很多抗腫瘤治療方法是通過誘導(dǎo)腫瘤

2、細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用,因此,尋找能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì),通過激發(fā)肝癌細(xì)胞的凋亡途徑,達(dá)到治療肝癌的目的是肝癌防治的有效方法之一。由于FasL具有抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能,FasL療法的臨床研究已在許多國家開展。動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均表明,FasL對某些腫瘤具有明顯的抑制作用；但是由于副作用較大,為FasL的臨床應(yīng)用造成困難。患者常因不能耐受其毒副作用而終止用藥。為了降低FasL的副作用,臨床多采用局部用藥、聯(lián)合用藥、溫?zé)岑煼ǖ取１M

3、可能降低FasL用藥量,增強(qiáng)療效而不損傷正常細(xì)胞,然而,欲從根本上解決FasL的療效問題還需要對FasL進(jìn)行遺傳改造以獲得高特異性、低毒性的新一代FasL,有關(guān)這方面的工作,目前主要集中在以下兩個方面：一是根據(jù)FasL結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究結(jié)果,通過遺傳操作,獲得FasL突變體,降低其毒副作用；二是將FasL與其它蛋白共同構(gòu)建雙功能的融合蛋白,實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療。腫瘤靶向治療是利用特異性的載體或?qū)蛳到y(tǒng),將藥物或其他殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)選

4、擇性地運(yùn)送到腫瘤部位,而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能,從而提高療效、減少毒副作用。腫瘤靶向治療中治療靶點(diǎn)、靶向載體和效應(yīng)分子的選擇是關(guān)鍵。整合素是一類膜受體家族,由α和β兩個亞單位組成。在部分腫瘤細(xì)胞或者腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中,常特異性地高表達(dá)某些整合素,如αvβ3,而正常細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)量很低。整合素αvβ3在腫瘤新生血管形成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,可以作為一類新的腫瘤治療靶點(diǎn)；RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天門冬

5、氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血液中的粘附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白。研究發(fā)現(xiàn),大部分整合素與其配體的結(jié)合過程,是通過識別配體中所含的RGD序列來完成的。目前,利用噬菌體表面展示技術(shù),已經(jīng)篩選出與一類與整合素αvβ3特異性結(jié)合的RGD肽,即ACDCRGDCFCG(RGD-4C),這類RGD肽可以作為腫瘤靶向載體,特異性地引導(dǎo)抗腫瘤藥物到達(dá)腫瘤部位,殺滅腫瘤細(xì)胞。本研究以整合素αvβ3為靶點(diǎn),RG

6、D肽為靶向載體,FasL蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子,構(gòu)建雙靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-FasL,并檢測其生物學(xué)活性,為深入探討RGD-FasL的體內(nèi)靶向抑瘤活性及腫瘤治療應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。同時(shí)豐富了FasL在腫瘤治療中的應(yīng)用形式,為腫瘤靶向治療提供了新思路。我們獲得RGD-FasL基因,構(gòu)建到表達(dá)載體pGEX-5X-1,通過酶切、測序鑒定陽性重組載體。含重組質(zhì)粒pGEX-5X-1/RGD-FasL的E.coli BL21DE(3)經(jīng)IPTG誘

7、導(dǎo)表達(dá)后,通過不同的誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),確定其最適表達(dá)條件為IPTG終濃度為0.5mmol/L、30℃誘導(dǎo)12 h。目的蛋白主要存在包涵體裂解液上清中,表達(dá)量占菌體總蛋白的30%以上,過GST Resin柱純化。經(jīng)SDS-PAGE分析在Mr 62 000附近有一特異條帶,符合目的蛋白理論推算值(Mr約62 700),掃描分析顯示其純度達(dá)95%以上,透析和稀釋復(fù)性制備正確折疊的融合蛋白。通過流式細(xì)胞儀檢測肝癌分子表面

8、Fas,CD61的表達(dá),通過體外粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGD-FasL具有靶向性,從而為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了有力基礎(chǔ)。MTT比色實(shí)驗(yàn)證實(shí),RGD-FasL能抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22和人肝癌H9101細(xì)胞生長,對正常小鼠肝細(xì)胞生長沒有影響；通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)定量分析技術(shù)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)方法分析證實(shí)RGD-FasL誘導(dǎo)H22和H9101細(xì)胞凋亡能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示RGD-FasL

9、融合蛋白能有效抑制鼠源性肝癌的生長。在H22小鼠模型中,當(dāng)RGD-FasL劑量為200mg/kg時(shí),RGD-FasL的抑瘤率為62.5%,優(yōu)于相同劑量的FasL的抑瘤率(51.3%)：免疫組化及HE染色組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)RGD-FasL能選擇性作用于腫瘤組織,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,而對正常組織及肝組織沒有毒副作用。本研究表明：融合蛋白RGD-FasL具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞生長的能力。同時(shí)RGD-FasL能夠特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞,具有腫