葉酸介導的復方多功能納米膠束的構建及評價.pdf

1、腫瘤多藥耐藥性系指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時,對其他許多結構不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物亦產生交叉抗藥性,它是一種獨特的廣譜耐藥現象。腫瘤MDR形成機制非常復雜,在已闡明的多種腫瘤細胞的耐藥機理中,藥物外排泵蛋白P-糖蛋白(P-gp)在細胞膜上的過度表達是腫瘤MDR產生的主要原因。目前,針對P-gp耐藥蛋白和耐藥機制,腫瘤MDR的逆轉策略主要體現在采用載體給藥系統(tǒng)和多藥耐藥逆轉劑逆轉MDR。
　　紫杉醇最早是新型抗腫

2、瘤活性成分,主要用于治療轉移性卵巢癌和乳腺癌。維拉帕米作為一種鈣離子通道阻滯劑,也是應用最早的MDR逆轉劑。本實驗中將維拉帕米和紫杉醇共同包載在DOMC-FA載體內制備紫杉醇抗耐藥性主動靶向制劑。
　　首先,用脫氧膽酸疏水性修飾O-羧甲基殼聚糖,得到一種兩親性的聚合物,然后與葉酸偶聯(lián)開發(fā)一種新型的具有潛在腫瘤靶向作用的藥物傳輸系統(tǒng)。實驗通過紅外光譜法、核磁共振波譜法(氫譜)、X-射線衍射分析了聚合物的結構特征。說明脫氧膽酸和葉酸成

3、功的接枝到O-羧甲基殼聚糖上。聚合物在水溶液中的自聚集的理化性質通過核磁共振波譜法、粒徑測定、Zeta電勢、熒光色譜、透射電鏡方法得以研究。在pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液中,自聚集物的平均粒徑大小隨著脫氧膽酸取代度的增加而減小。DOMC和DOMC-FA自聚物的平均粒徑分別在231-383nm和179-212nm,并且具有窄的和單式的粒徑分布。自聚物的透射電鏡形態(tài)為球形的。自聚集體的Zeta電勢在.20 mV左右,其表面被帶負電荷的O-羧甲

4、基殼聚糖所覆蓋。聚合物的臨界角束濃度與脫氧膽酸的取代度有關,其值比低分子量的表面活性劑稍低。DOMC的臨界角束濃度范圍為0.027-0.065 mg/mL,DOMC-FA的臨界角束濃度值比DOMC7稍微小一些。聚合物的平均粒徑和臨界角束濃度值依賴于其取代度,并且隨著pH的變化而有所變化。
　　通過實驗考查以自組裝法制備載藥納米膠束。制備的DOMC-FA/PTX納米膠束的載藥量為33.61%,包封率高達84.32%,膠束的平均粒徑為

5、258.2 nm,粒徑分布的范圍均較窄。用與載紫杉醇相似的工藝包載維拉帕米,DOMC-FA/VRP納米膠束的藥物和載體質量選擇為15:25時,其相應的載藥量高達33.42%,包封率高達82.28%;DOMC-FA/(PTX+VRP)納米膠束中紫杉醇和維拉帕米的包封率依次為95.28%和71.15%,DOMC-FA/VRP膠束的平均粒徑為269.7 nm,DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束的平均粒徑為299.4 nm,粒徑分布的范圍均

6、較窄。所制備納米膠束的Zeta電勢值均為負值,大約-18mV,說明納米膠束的表面被羧甲基殼聚糖帶負電的羧基所覆蓋。納米膠束室溫放置3個月后,其外觀、粒徑和包封率均無較大的改變;而在冷藏條件下放置6個月后,外觀、粒徑和包封率略有變化,但仍符合要求,說明載藥納米膠束具有較好的穩(wěn)定性。
　　體外釋放試驗中,兩種DOMC/PTX和DOMC-FA/PTX納米膠束的累積釋藥曲線相似,與紫杉醇溶液的釋藥相比具有很明顯的緩釋作用。載藥的DOMC和

7、DOMC-FA膠束是一種復雜體系,DOMC的消化和降解比較緩慢,因此藥物的釋放呈現緩釋行為。說明這種膠束載體不僅增加了難溶性藥物的溶解度,而且持續(xù)控制藥物的釋放。DOMC-FA/VRP和DOMC-FA/(PTX+VRP)納米膠束中紫杉醇和維拉帕米的累積釋藥曲線相似,與其溶液的釋藥相比具有很明顯的緩釋作用。DOMC-FA/(PTX+VRP)中紫杉醇的釋藥速率較維拉帕米慢,但二者從DOMC-FA/(PTX+VRP)釋放出的分子摩爾比例仍然在

8、1:250左右,不影響協(xié)同耐藥的逆轉效果,進一步說明DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束能夠很好的控制釋放藥物達到腫瘤的有效治療。再者,藥物從膠束中的釋放呈現一定的pH依賴性。從而進一步說明,該納米膠束載體系統(tǒng)能夠在腫瘤部位釋放更多的藥物,在腫瘤的治愈方面有潛在的價值。
　　為了研究葉酸靶向膠束被葉酸受體表達細胞的攝取,MCF-7細胞用游離羅丹明-123溶液、載羅丹明-123普通膠束(DOMC/R-123)、載羅丹明-123葉酸

9、靶向膠束(DOMC-FA/R-123)培養(yǎng)不同的時間。結果表明,靶向DOMC-FA/R-123納米膠束攝取量增高是葉酸受體介導的胞吞作用的增強所致。游離葉酸可競爭性抑制細胞對DOMC-FA/R-123納米膠束的攝取,說明DOMC-FA/R-123納米膠束進入細胞主要通過MCF-7細胞表面過渡表達的葉酸受體和靶向DOMC-FA膠束表面葉酸結合而實現細胞的內攝作用。
　　敏感MCF-7細胞的MTT試驗、細胞形態(tài)觀察、凋亡試驗證實葉酸修

10、飾的膠束可通過葉酸介導的細胞內攝作用增強腫瘤細胞的殺傷效果。載紫杉醇葉酸膠束(DOMC-FA/PTX)比紫杉醇普通膠束(DOMC/PTX)和市售紫杉醇制劑(Taxol注射液)顯示更強的腫瘤細胞毒性作用。這些結果說明,葉酸修飾的聚合物膠束可靶向輸送紫杉醇到腫瘤細胞內,并可降低抗癌藥物的毒副作用,在實體腫瘤的治療方面有潛在的應用價值。
　　DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束對耐藥MCF-7/ADR細胞顯示出比其它制劑強的毒性行為,

11、這主要是因為葉酸受體介導的細胞內吞作用和維拉帕米介導的P-糖蛋抑制作用的協(xié)同效果,因而,增強了紫杉醇誘導的細胞毒性、逆轉了腫瘤細胞的耐藥現象。說明,DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束是具有維拉帕米介導的P-糖蛋抑制和葉酸受體介導的細胞內吞的兩種機制結合的逆轉腫瘤多藥耐藥的雙功能膠束系統(tǒng),其在多藥耐藥實體腫瘤的治療方面會有很好的治療效果。
　　由小鼠體內組織分布試驗表明,小鼠尾靜脈注射Taxol注射液和DOMC-FA/PTX膠束

12、后藥物在各組織器官的分布發(fā)生了改變。結果表明PTX制成DOMC-FA/PTX膠束后可明顯延長藥物在體內的平均滯留時間,具有明顯緩釋效應,有助于提高藥物的療效。靶向性評價結果顯示,與Taxol注射液相比PTX制成DOMC-FA/PTX膠束后體內行為發(fā)生了明顯改變,相對攝取率re從高到低依次為脾8.29、肺3.82、肝1.78、血漿1.31、心0.62、腎0.35,顯示出明顯的脾和肺靶向。DOMC-FA/PTX膠束可靶向于肝臟,肝臟中藥物分

13、布量占很大的給藥量,藥物蓄積于肝臟并形成藥物儲庫。數據表明,DOMC-FA/PTX膠束可極大提高藥物在脾臟和肝臟的分布,有助于肝脾疾病的臨床治療,且以肝脾為藥物儲庫緩慢釋放藥物;同時肺中分布與Taxol注射液相比顯著提高,且具有更強的滯留特性,對于PTX對肺中腫瘤疾病的治療具有重要的臨床意義;PTX的主要毒性在于骨髓抑制、心臟毒性和腎毒性,DOMC-FA/PTX膠束使PTX在心、腎的分布極大降低,心臟和腎臟毒性的減少對于PTX的臨床應用

14、具有重要意義。
　　家兔體內的藥物動力學研究結果表明,Taxol-Sol和DOMC-FA/PTX膠束注射后其血藥濃度.時間曲線特征明顯不同。Taxol-Sol血藥濃度下降較快呈現出較陡的趨勢,PTX在體內很快的被清除;而DOMC-FA/PTX的血藥濃度曲線則更為平穩(wěn)、持久,血藥濃度在12 h時仍能維持較高水平(0.23μg·ml-1)。兩種制劑均符合雙室模型特征,藥物動力學方程分別為C=30.49e-2.634+5.64le-.6

15、16t,C=26.422e-1.157t+8.213e-0.302t。通過比較藥動學參數表可知,Taxol注射液的分布和消除均快于納米膠束組,DOMC-FA/PTX膠束的AUC值(53.217mg/L·h)明顯高于Taxol注射液的AUC值(23.288 mg/L·h);納米膠束的MRT(1.913h)高于Taxol注射液的MRT(0.892h);膠束的機體總清除率CL(0.158L/h/kg)小于Taxol注射液的機體總清除率CL(0