Riccardin D納米晶被動(dòng)靶向與多功能納米膠束主動(dòng)靶向釋藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、羽苔素(Riccardin D，RD)，是由苔蘚植物地錢中提取分離得到的一種新型的雙聯(lián)芐類化合物，具有抗真菌、逆轉(zhuǎn)真菌多藥耐藥性、以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種藥理作用。然而RD溶解性差導(dǎo)致的低生物利用度等系列問題阻礙了其轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用的可能。為此，本文擬通過(guò)制備RD納米混懸劑，增加其溶解度，提高生物利用度，以達(dá)到臨床前藥學(xué)評(píng)價(jià)的目的。在完成臨床前藥學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，以RD為模型藥物，以生物相容性好的羧甲基殼聚糖-脫氧膽酸為骨架材料，接枝具有pH敏

2、感性的聚（β-氨基酯）和能夠識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞受體靶點(diǎn)的葉酸，并在膠束外層連接PEG親水端，制備成在體內(nèi)具有pH敏感性、主動(dòng)靶向性且延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的多功能膠束，以延長(zhǎng)RD制劑的半衰期并增強(qiáng)其主動(dòng)靶向性。因此，全文分為兩個(gè)部分:第一部分為RD臨床前藥學(xué)評(píng)價(jià)的一部分，即RD納米混懸液的研究;第二部分在第一部分基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，以開發(fā)新劑型和新技術(shù)為目的，制備成RD多功能膠束。
　　在本課題第一部分研究中，采用沉淀法和微射流法兩種方法制備

3、了納米混懸液。通過(guò)透射電鏡觀察其形態(tài)，并對(duì)其粒徑分布、表面電荷進(jìn)行了研究。在沉淀法中，以溶解RD的乙醇溶液等有機(jī)相作為溶劑，將穩(wěn)定劑泊洛沙姆188(F68)、羥丙甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)溶解于水相作為反溶劑，溶劑與反溶劑混合后制備納米混懸劑。在微射流法中，考察均質(zhì)壓力與循環(huán)次數(shù)對(duì)納米混懸液的影響。理化性質(zhì)研究表明，通過(guò)沉淀法制備的納米混懸液比微射流法制備的納米混懸液粒徑更小且更加均勻。為進(jìn)一步提高納

4、米混懸劑的穩(wěn)定性，本課題系統(tǒng)研究了RD納米混懸劑的冷凍干燥過(guò)程，利用LC-MS及HPLC考察了RD凍干粉的飽和溶解度、體外溶出度及儲(chǔ)存穩(wěn)定性，采用DSC和XRD技術(shù)對(duì)其晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。最后利用HPLC比較了兩種方法制備的RD納米混懸液經(jīng)靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的組織分布特征以及藥物動(dòng)力學(xué)特征，以期通過(guò)增加肺靶向的分布實(shí)現(xiàn)RD對(duì)肺部疾病治療的目的。
　　通過(guò)處方篩選，沉淀法的最佳處方確定為RD∶F68∶HPMC∶PVP K30=2∶

5、1∶2∶1，選用穩(wěn)定性能良好的F68、HPMC、PVPK30作為穩(wěn)定劑。將處方量的RD溶于無(wú)水乙醇中作為有機(jī)相;將處方量的穩(wěn)定劑均勻分散在雙蒸水中得到水相;0-3℃冰浴和攪拌條件下，將制得的有機(jī)相分散于水相中，低溫固化后，得RD納米混懸液A，簡(jiǎn)稱RD-NA。微射流制備方法如下:將RD和穩(wěn)定劑在攪拌條件下分散于水中，超聲分散后制得粗混懸劑，將粗混懸劑通過(guò)高速剪切機(jī)15000轉(zhuǎn)/分鐘剪切1分鐘后，經(jīng)高壓微射流納米分散儀，以2000 bar壓

6、力下均質(zhì)8次，得RD納米結(jié)晶混懸液B，簡(jiǎn)稱RD-NB。兩種制備方法工藝操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性良好，透射電鏡下觀察所得的RD納米結(jié)晶為顆粒狀結(jié)晶，表面不粘連，粒徑分布較窄，平均粒徑分別為184.10±3.15 nm和815.37±9.65 nm，Zeta電位分別為-27.89±0.84mV和-17.43±0.76 mV。
　　為進(jìn)一步對(duì)提高所制備的納米混懸劑的穩(wěn)定性，采用冷凍干燥技術(shù)，將RD膠體混懸液制成凍干粉針劑。其凍干工藝:經(jīng)優(yōu)化工藝

7、制備的RD納米混懸液加入5％甘露醇作為支架劑，振搖溶解，分裝于15 mL西林瓶中，置于-80℃的超低溫冰箱中冷凍48 h，取出后迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中，于-50℃真空條件下凍干48 h，即得RD的凍干品。質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明凍干過(guò)程對(duì)藥物的粒徑和Zeta電位影響較小。對(duì)凍干品的DSC和XRD分析結(jié)果表明，制成納米混懸液后，藥物納米粒子仍維持原有的晶型結(jié)構(gòu)。以RD凍干粉的外觀、再分散性、粒徑和Zeta電位等為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了RD凍干粉的初步穩(wěn)定性

8、，結(jié)果顯示RD凍干粉在4℃冷藏條件下放置一個(gè)月，其物理化學(xué)穩(wěn)定性良好。RD納米混懸劑凍干粉的飽和溶解度結(jié)果表明，將RD制備成納米混懸劑后，其溶解度由0.619±0.245μg/mL提高到了222.1±10.5μg/mL和30.5±2.1μg/mL;通過(guò)漿法對(duì)RD凍干粉的體外溶出進(jìn)行考察，結(jié)果表明，與原料藥相比，納米凍干粉末大大提高了RD的溶出速率。
　　本文采用HPLC法，研究了小鼠尾靜脈注射RD溶液劑（RD-Sol）、RD納米混

9、懸液A(RD-NA)和RD納米混懸液B(RD-NB)后藥物在體內(nèi)的組織分布情況。RD-NB與RD-Sol和RD-NA相比，顯著提高了藥物在肺中的濃度水平，并延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間。因此，RD-NB能夠使羽苔素靶向濃集于肺中，從而可能提高羽苔素的治療效果，具有重要的潛在臨床價(jià)值。
　　大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明RD-NA與RD-Sol的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相似，但與RD-NB的血藥濃度-時(shí)間曲線有顯著不同。三種制劑均按注射RD80

10、mg/kg計(jì)，靜脈注射RD-Sol后，大鼠體內(nèi)清除率CLz為4.2 L·h-1·Kg-1，平均滯留時(shí)間MRT為2.75 h，AUC為16.7 h·μg·mL-1;與其相似的是注射RD-NA后，CLz為4.245 L·h-1·Kg-1，MRT為2.183 h，AUC為17.35 h·μg·mL-1。而靜脈注射RD-NB后，平均滯留時(shí)間MRT有所延長(zhǎng)，清除率則顯著下降，MRT為4.277 h，CLz為1.717 L·h-1·Kg-1，AUC

11、為45.95 h·μg·mL-1，約為另外兩組的3倍。
　　以RD為模型藥物制備納米混懸液的研究，是RD藥物臨床前藥學(xué)評(píng)價(jià)的一部分，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為難溶性藥物注射劑的開發(fā)提供了思路，并對(duì)治療肺癌疾病藥物注射劑的臨床開發(fā)應(yīng)用有重要的意義。為了提高藥物制劑對(duì)特定靶點(diǎn)的靶向性，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，提高藥物的生物利用度，本課題進(jìn)行了第二部分的實(shí)驗(yàn)研究。
　　本第二部分，以第一部分研究?jī)?nèi)容為基礎(chǔ)，制備了多功能自組裝膠束。自

12、組裝聚合物納米膠束具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，內(nèi)核可以作為疏水性藥物RD的儲(chǔ)庫(kù)，親水性外殼PEG具有延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的作用，并可以通過(guò)化學(xué)修飾實(shí)現(xiàn)葉酸進(jìn)行主動(dòng)靶向、聚（β-氨基酯）響應(yīng)微環(huán)境(pH敏感)、PEG修飾逃避單核細(xì)胞的吞噬等目的，因此自組裝聚合物納米膠束在藥物遞送方面具有重大潛力，受到越來(lái)越多藥學(xué)工作者的關(guān)注。
　　首先，用疏水性的脫氧膽酸(DOCA)修飾O-羧甲基殼聚糖(OCMC)，制備兩親性的聚合物骨架DOMC，然后與葉

13、酸(FA)和聚（β-氨基酯）-聚乙二醇(PAE-PEG)偶聯(lián)，開發(fā)一種新型的具有主動(dòng)腫瘤靶向作用的藥物傳輸系統(tǒng)。通過(guò)紅外光譜法(IR)、核磁共振波譜法(NMR-1H)分析了聚合物的結(jié)構(gòu)特征，證明脫氧膽酸、葉酸以及PEG-PAE成功的接枝到O-羧甲基殼聚糖上。通過(guò)粒徑測(cè)定、Zeta電勢(shì)、透射電鏡等方法研究了聚合物在水溶液中的自聚集的理化性質(zhì)。在pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，DOMC-FA和PEG-PAE-DOMC-FA自聚物粒徑小，且具有

14、窄的粒徑分布;在pH5.0的磷酸緩沖液溶液中，自聚物的粒徑均明顯變大。透射電鏡中自聚物的形態(tài)為球形。DOMC-FA自聚集體的Zeta電勢(shì)在-20 mV左右，其表面被帶負(fù)電荷的O-羧甲基殼聚糖覆蓋。PEG-PAE-DOMC-FA的Zeta電位約為-4mV左右，這是由于PAE-PEG在pH5.0時(shí)基團(tuán)帶有正電荷的原因。與粒徑和電位的結(jié)果一樣，臨界膠束濃度也隨著pH的變化而有所變化。溶血性實(shí)驗(yàn)確保了兩種膠束動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的安全性。
　　構(gòu)建和

15、表征了以自組裝法制備的載藥納米膠束。制備的DOMC-FA/RD和PEG-PAE-DOMC-FA/RD納米膠束在pH7.4時(shí)的載藥量分別為22.78％和32.27％，包封率高達(dá)45.57％和64.53％，膠束的平均粒徑分別為153.6nm和210.5 nm，粒徑分布的范圍均較窄(PDI＜0.25)。所制備納米膠束的Zeta電勢(shì)值均為負(fù)值，大約為-20mV，說(shuō)明納米膠束的表面被羧甲基殼聚糖帶負(fù)電的羧基所覆蓋。而在pH5.0時(shí)，兩種膠束的載藥

16、量和包封率均降低，且粒徑明顯變大，膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。納米膠束室溫放置3個(gè)月后，其外觀、粒徑和包封率均無(wú)較大的改變;而在4℃冷藏條件下放置6個(gè)月后，外觀、粒徑和包封率略有變化，但仍符合要求，說(shuō)明載藥納米膠束具有較好的穩(wěn)定性。體外釋放試驗(yàn)中，PEG-PAE-DOMC-FA/RD納米膠束在pH7.4時(shí)的累積釋藥表現(xiàn)出明顯的緩釋作用。最重要的是，藥物從膠束中的釋放呈現(xiàn)一定的pH依賴性。從而進(jìn)一步提示，該納米膠束載體系統(tǒng)能夠在腫瘤部位pH依賴性的

17、持續(xù)釋放藥物，對(duì)抗腫瘤治療具有潛在價(jià)值。
　　為了研究葉酸靶向膠束被葉酸受體表達(dá)細(xì)胞的攝取，MCF-7細(xì)胞用香豆素-6溶液、載香豆素-6的DOMC-FA膠束溶液、載香豆素-6的PEG-PAE-DOMC-FA/RD膠束溶液培養(yǎng)不同的時(shí)間。結(jié)果表明，由于葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用的增強(qiáng)，兩種接枝FA的納米膠束攝取量均增高。MCF-7細(xì)胞的MTT試驗(yàn)、凋亡試驗(yàn)證實(shí)葉酸修飾的膠束可通過(guò)葉酸介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝作用增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，而PEG-P

18、AE繼續(xù)修飾會(huì)增強(qiáng)殺傷效果。載RD的pH敏感型葉酸介導(dǎo)膠束(PEG-PAE-DOMC-FA/RD)比葉酸介導(dǎo)膠束(DOMC-FA/RD)和自制的RD溶液表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性。這些結(jié)果說(shuō)明，葉酸修飾的聚合物膠束可靶向輸送RD到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而PEG-PAE基團(tuán)帶正電荷增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用，并可降低抗癌藥物的毒副作用，在實(shí)體腫瘤的治療方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　小鼠體內(nèi)組織分布研究表明，小鼠尾靜脈注射RD-Sol、DOMC-F

19、A/RD和PEG-PAE-DOMC-FA/RD膠束后藥物在各組織器官的分布發(fā)生了改變。結(jié)果表明RD制成PEG-PAE-DOMC-FA/RD膠束后可明顯延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間，具有明顯緩釋效應(yīng)，有助于提高藥物的療效。靶向性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，與RD-Sol注射液相比，RD制成PEG-PAE-DOMC-FA/RD膠束后體內(nèi)行為發(fā)生了明顯改變，相對(duì)攝取率re從高到低依次為血3.79、肺1.33、肝0.80、腎0.65、脾0.42、心0.38，

20、明顯在血液中滯留。一般化療藥物的主要毒性在于心臟毒性和腎毒性，PEG-PAE-DOMC-FA/RD膠束降低了RD在心、腎的分布，減少了對(duì)心臟和腎臟的毒性，從而對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。
　　藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，RD-Sol和DOMC-FA/RD膠束注射后其t1/2β相似，而PEG-PAE-DOMC-FA/RD的t1/2β提高了近10倍。RD-Sol和DOMC-FA/RD的AUC(0-∞)分別為36.1 mg/L·h和34.5mg

21、/L·h，而PEG-PAE-DOMC-FA/RD的AUC(0-∞)為123.8 mg/L·h，明顯高于前兩組制劑。而三種制劑中RD的清除率分別是1.108、1.159和0.323 L/h/kg，且PEG-PAE-DOMC-FA/RD制劑中RD的MRT平均滯留時(shí)間最長(zhǎng)。因此，RD制備成PEG包裹的納米膠束制劑后可以顯著延長(zhǎng)藥物在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，有助于提高RD的抗癌效果。
　　采用動(dòng)物移植性腫瘤的實(shí)驗(yàn)方法，將人源性MCF-7細(xì)胞接

22、種于裸鼠皮下，進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在相同藥物劑量時(shí)，RD溶液組的抗腫瘤活性最差，PEG-PAE-DOMC-FA/RD和 DOMC-FA/RD的抑瘤率均有提高，且PEG-PAE-DOMC-FA/RD的抑瘤效果更明顯。給藥過(guò)程中，所有制劑組動(dòng)物均未有明顯體重變化，證明幾種制劑在給藥劑量下體內(nèi)毒性均較小。
　　第二部分研究選用具有環(huán)境pH敏感型智能聚合物材料作為抗腫瘤藥物RD的載體，首次同時(shí)將具有pH敏感性的PAE-PEG和主動(dòng)