抗體靶向多功能金納米粒子的設計、合成與生物活性研究.pdf

1、第一章
　　 前言
　　 近年來，納米技術迅猛發(fā)展，在生物醫(yī)學領域的應用不斷取得突破性進展。許多納米平臺如脂質體、聚合物、結合蛋白、金納米粒子、超順磁性鐵氧化物以及量子點等已經被開發(fā)，并應用于腫瘤的診斷與治療。其中，金納米粒子由于具有較好的生物兼容性、尺寸形狀依賴的光學與電學特性以及易于修飾的化學表面等獨特的物理化學性質，而表現(xiàn)出了能夠向臨床轉化的能力。該部分內容綜述了金納米粒子的制備、修飾以及其在生物醫(yī)學領域應用的最新

2、進展。
　　 第二章
　　 具有抗體靶向性與細胞周期調控功能的金納米粒子增強X-射線對成神經細胞瘤細胞的毒性
　　 在兒童時期，成神經細胞瘤是最普遍的顱外實體瘤。50％以上的病例出現(xiàn)在小于兩歲的兒童群體中。現(xiàn)有治療手段主要為手術、化療、放射治療及干細胞移植。但是，這些治療手段對于兒童存在明顯的副作用，例如導致生長延遲、聽力喪失及后天學習障礙等。盡管能夠進行綜合治療，該類腫瘤的復發(fā)仍然會奪走許多晚期病人（第四期）的

3、生命。根據(jù)美國田納西州StJudeChildren'sResearchHospital的臨床統(tǒng)計，該類病人的五年存活率僅為55％。因而，對于兒童而言，亟待開發(fā)更加高效且腫瘤特異性的治療手段。
　　 GD2神經節(jié)苷脂為一類在神經外胚層起源的腫瘤（如成神經細胞瘤、黑色素瘤）表面表達的抗原;在正常組織中，GD2的表達僅局限于神經元、皮膚黑色素細胞及外周疼痛纖維;這些性質使得GD2成為一個理想的抗體治療靶點。許多抗GD2抗體已經被開發(fā)并

4、應用于臨床，例如3F8、14G2a、ch14.18、hu14.18以及hu14.18K322A等。其中，hu14.18K322A為MerckKGaA公司開發(fā)的一個人源化的抗GD2抗體，在StJudeChildren'sResearchHospital，該抗體正處于免疫治療的一期臨床階段。與hu14.18相比，hu14.18K322A在K322氨基酸進行了突變，因而，hu14.18K322A表現(xiàn)出較小的補體激活效應，進而減少了免疫治療過程

5、中的副作用（如疼痛、發(fā)燒等癥狀）。本文僅僅利用hu14.18K322A作為金納米粒子識別成神經細胞瘤細胞的靶向分子，并不述及該抗體的發(fā)現(xiàn)過程、化學結構以及臨床實驗的結果。
　　 許多研究已經表明，金納米粒子能夠增強射線對腫瘤細胞的毒性，其作用機理為腫瘤細胞內的金納米粒子能夠增強腫瘤細胞的DNA損傷。但是，到目前為止，并未見到關于不同時期（如G1、S、G2/M）的細胞與金納米粒子之間相互作用的報道。在這一領域有大量的工作需要化學家

6、及生物學家去完成。另外有研究表明，在細胞周期的不同階段，細胞對射線（X-射線與伽馬射線）的敏感程度并不相同。例如處于S階段的細胞對射線有較強的耐受性，而處于G2/M階段的細胞對射線則非常敏感。因此，設計并合成具有細胞周期調控功能的金納米粒子對于研究不同時期（如G1、S、G2/M）的細胞與金納米粒子之間的相互作用以及開發(fā)新型且高效的成神經細胞瘤細胞特異性的X-射線增敏劑均具有重大意義。
　　 基于以上的理解，本文設計、合成了一種具

7、有抗體靶向性與細胞周期調控功能的金納米粒子-HPGNP，并對其生物、化學行為進行了詳細的研究。
　　 研究目的:合成具有抗體靶向性與細胞周期調控功能的金納米粒子-HPGNP;
　　 研究意義:(1)為研究不同時期（如G1、S、G2/M）的細胞與金納米粒子之間相互作用提供物質基礎;(2)開發(fā)新型且高效的成神經細胞瘤細胞特異性的X-射線增敏劑，降低放射治療的副作用、提高其治療效果。
　　 研究結果表明:(1)HPGN

8、P可以特異性地識別成神經細胞瘤細胞，這種特異性是通過hu14.18K322A-GD2的相互作用而實現(xiàn)的;HPGNP并不能識別GD2陰性的PC-3細胞;(2)HPGNP能夠被成神經細胞瘤細胞攝取，并將該類腫瘤細胞阻滯于G2/M階段（HPGNP并不能識別GD2陰性的PC-3細胞，亦不能將其阻滯于G2/M階段;在成神經細胞瘤細胞內，HPGNP主要存在于內吞體、溶酶體及細胞質內，這對于研究抗原介導的金納米粒子的內吞過程具有重要的參考價值）;(3

9、)與HGNP或PTX相比，HPGNP有效地增強了X-射線對成神經細胞瘤細胞的毒性，同時降低了X-射線對GD2陰性細胞的毒性。細胞在X-射線條件下的存活率:IMR-32（成神經細胞瘤細胞，GD2陽性）:82％（HGNP），77％(PTX)，19％（HPGNP）;CHLA-20（成神經細胞瘤細胞，GD2陽性）:80％(HGNP)，83％(PTX)，18％（HPGNP）;而對于GD2陰性的PC-3而言:99％（HGNP），63％(PTX)，9

10、7％(HPGNP)。這些研究結果表明:一方面HPGNP能夠識別成神經細胞瘤細胞并被其所攝取;在細胞內，被攝取的HPGNP能夠釋放出紫杉醇分子，并將成神經細胞瘤細胞阻滯于G2/M期，進而增強X-射線對成神經細胞瘤細胞的毒性;另一方面，HPGNP并不能識別GD2陰性的PC-3細胞，同時也不能進入GD2陰性的PC-3細胞內，因而，HPGNP能夠降低X-射線對GD2陰性細胞（正常細胞）的毒性。這些研究結果對于開發(fā)新型且高效的腫瘤治療手段、增強藥

11、物治療與放射治療的效果以及降低藥物治療與放射治療的副作用有重要的參考價值。本文的研究亦表現(xiàn)出納米醫(yī)學在腫瘤治療應用中的實力與靈活性。
　　 第三章
　　 Hu14.18K322A靶向的金納米粒子作為GD2陽性腫瘤細胞分子CT成像的對比試劑
　　 目前，常規(guī)的CT對比試劑為含碘的化合物，但這類化合物在實際應用中存在一定的局限性，例如成像時間較短(5-10min)、引起腎臟毒性和特異質反應（如蕁麻診、血管性水腫、喉頭

12、水腫、支氣管痙攣、嚴重血壓下降及突然死亡等）以及伴隨物理化學方面的反應（如惡心、嘔吐、潮紅、發(fā)熱及局部疼痛等），更為明顯的缺陷是現(xiàn)存的碘類化合物的對比試劑對腫瘤細胞并不具有特異性，同時亦不是分子CT的對比試劑。
　　 金納米粒子不僅能很好地吸收X-射線(100keV:gold,5.16cm2g-1;iodine，1.94cm2g-1)，而且其X-射線弱化能力（衰減）大大高于基于含碘化合物的對比試劑。因此，金納米粒子作為能夠CT成

13、像的對比試劑;而抗體靶向的金納米粒子將有可能被開發(fā)為分子CT成像的對比試劑。
　　 基于以上的理解，本文合成了hu14.18K322A靶向的金納米粒子-HGNP，并在體外研究了其作為分子CT成像對比試劑的效果。
　　 研究目的:設計、合成能夠作為分子CT成像對比試劑的金納米粒子-HGNP;
　　 研究意義:(1)開發(fā)新型的GD2特異性的分子CT對比試劑，以提高CT成像在成神經細胞瘤及黑色素瘤診斷中的靈敏度;(2)

14、Hu14.18K322A在StJudeChildren'sResearchHospital正處于一期臨床階段，本文為hu14.18K322A的臨床研究提了供標記的手段（金納米粒子作為標記的材料）。
　　 研究結果表明，HGNP特異性識別GD2陽性的成神經細胞瘤細胞與黑色素瘤細胞，并被這些細胞所攝取。對于GD2陽性細胞或GD2陰性細胞，HGNP均未表現(xiàn)出細胞毒性，這表明該納米粒子具有較好的生物兼容性，可以用于鼠模型體內分子CT成像

15、的研究。當有NK細胞存在時，該納米粒子能夠殺死成神經細胞瘤細胞。這表明HGNP保留了hu14.18K322A所具有的抗體依賴細胞毒性(ADCC)的性質，即HGNP在體內將有可能尋找并殺死GD2陽性的腫瘤細胞。在合成方面，這一結果亦間接地證明了hu14.18K322A與GNPs的結合方式是隨機結合而不是定向結合。在CT條件下，HGNP能夠增強GD2陽性腫瘤細胞與周圍環(huán)境的對比性。這使得CT能夠檢測出成神經細胞瘤細胞與黑色素瘤細胞的分子標記