木瓜復(fù)合抗氧化體系的重組及其抗ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、本研究選用含豐富抗氧化組分的木瓜為原料，采用生物酶解、環(huán)糊精包合和噴霧制粒技術(shù)，將存在于植物體組織中的抗氧化物質(zhì)抽提出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行包合修飾，重新將其固化在環(huán)糊精給藥載體上，將這種重新組合的木瓜復(fù)合抗氧化物添加入高脂飼料中，喂飼ApoE基因缺陷小鼠，對(duì)木瓜抗氧化體系防治AS的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行研究和探討。 方法： 采用纖維素.果膠酶處理木瓜，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲取最優(yōu)酶解工藝；對(duì)提取的木瓜抗氧化復(fù)合物中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行TL

2、C薄層色譜鑒定，采用λ-環(huán)糊精包合技術(shù)對(duì)酶解提取的木瓜復(fù)合抗氧化物進(jìn)行包合修飾；采用流化床噴霧制粒技術(shù)制備由β-環(huán)糊精為主要載體的重組木瓜復(fù)合抗氧化物顆粒；比較木瓜果實(shí)及CSP中維生素C含量、總酚量、單寧量以及FRAP、SOD的活性；采用改良的DPPH微孔板定量法評(píng)測(cè)加工重組前后總抗氧化能力的變化，并結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線分析木瓜抗氧化體系重組前后其抗氧化特征變化。 選用ApoE-/-雄性2月齡小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組

3、、CSP低劑量組、CSP高劑量組、超微茶粉組、維生素C組，在SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)16周，眼眶取血測(cè)定血脂、血清總抗氧化能力和血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；免疫組化測(cè)定斑塊TNF-α表達(dá)水平，免疫熒光檢測(cè)CD68表達(dá)水平和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)；HE染色分析主動(dòng)脈竇斑塊面積率及主動(dòng)脈弓中內(nèi)膜厚度，；油紅O染色降主動(dòng)脈分析脂質(zhì)沉積血管內(nèi)膜狀況，結(jié)合電鏡掃描闡述動(dòng)脈血管內(nèi)壁微觀變化。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.酶解處理木瓜果實(shí)體顯著提高了木瓜出

4、汁率，其最優(yōu)酶解工藝為果膠酶添加量2％，纖維素酶添加量2％，溫度40℃，時(shí)間60分鐘。酶解技術(shù)的運(yùn)用使木瓜主要抗氧化物--維生素C、總酚、單寧和黃酮提取總量分別提高了35.1％、43.8％、45.3％和46.7％。通過(guò)TLC色譜鑒定，木瓜提取物中含有兒茶素、表兒茶素和槲皮素、蘆丁、綠原酸和原花青素。酶解使木瓜組織細(xì)胞壁崩解，這有利于完整地將木瓜原有的抗氧化組分浸提出來(lái)、重組到環(huán)糊精給藥載體上。 2.γ-環(huán)糊精通過(guò)單一物質(zhì)包合反應(yīng)

5、驗(yàn)證了其對(duì)木瓜含有的維生素C、原花青素、綠原酸和蘆丁具有包合作用。多酚類物質(zhì)的包合常數(shù)在2.8×103～4.2×104之間，其Ka隨多酚物質(zhì)分子量增加而增大；γ-環(huán)糊精對(duì)維生素C的包合常數(shù)也達(dá)到了5.7×103。木瓜酶解提取復(fù)合物與γ-環(huán)糊精反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的包合常數(shù)為1.9×103，表明包合反應(yīng)充分。包合修飾的實(shí)現(xiàn)有助于后期重組固化制粒的加工穩(wěn)定性、耐儲(chǔ)藏性及生物利用率的提高。 3.采用頂噴流化床噴霧制粒工藝，流化床體中心溫度4

6、5℃、風(fēng)機(jī)頻率4～5kHz、進(jìn)料泵3～5Hz、抖料器頻率35～40次/min；獲得的重組木瓜復(fù)合抗氧化物每克含有維生素C、總酚、單寧含量分別為2.05±0.09mg、22.70±1.57mg和9.64±0.65mg，比重組前的木瓜抗氧化體系單位質(zhì)量含有的維生素C、總酚和單寧量提高了219.8％、344.2％、348.4％；每克CSP的SOD活性、FRAP和TAC分別為700±21U、172.9±6.7μmolFe2+、945±20μg

7、DPPH·，比重組前的木瓜抗氧化體系單位質(zhì)量的SOD活性、FRAP和TAC提高了236.5％、213.8％、300.4％。 4.改良創(chuàng)新了DPPH·微孔板測(cè)定技術(shù)測(cè)定植物總抗氧化能力，不僅具有批處理量大、節(jié)約試劑和減少系統(tǒng)誤差的優(yōu)點(diǎn)，還能同時(shí)完成對(duì)抗氧化組分物質(zhì)清除自由基反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征的測(cè)定。 5.木瓜復(fù)合抗氧化物在抗ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)效應(yīng)方面，其組織病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為：CSP顯著減少了降主動(dòng)脈管壁

8、內(nèi)表面的脂質(zhì)沉積發(fā)生，5％和10％的CSP干預(yù)后ApoE-/-小鼠降主動(dòng)脈管壁內(nèi)表面的脂質(zhì)沉積面積率分別為0.22和O.12；對(duì)比Control組，5％、10％的CSP添加分別使ApoE-/-小鼠降主動(dòng)脈管壁內(nèi)表面脂質(zhì)沉積減少了40.8％和67.3％。CSP顯著抑制了主動(dòng)脈弓中內(nèi)膜增厚的病變，低劑量和高劑量CSP干預(yù)后的ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈弓中內(nèi)膜厚度均值分別為128.9和95.5；對(duì)比Control組，5％、10％的CSP添加分

9、別減少了ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓中內(nèi)膜30.1％和48.2％的增厚量。CSP顯著減小了主動(dòng)脈竇斑塊的尺寸，5％和10％的CSP干預(yù)后ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊面積率分別為0.339和0.276：對(duì)比Control組，添加5％的CSP使ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊縮小了23.1％，添加10％的CSP使ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊縮小了38.1％。實(shí)驗(yàn)表明重組的木瓜抗氧化物從AS的發(fā)生階段--“脂質(zhì)沉積”到AS的發(fā)展階段--

10、“斑塊形成”，都表現(xiàn)出了抗AS的生物學(xué)效應(yīng)。 6.木瓜復(fù)合抗氧化物抗AS的相關(guān)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及結(jié)論： 1)木瓜復(fù)合抗氧化物顯著降低了ApoE-/-小鼠的TC、TG、LDL-C水平。對(duì)比Control組血脂指標(biāo)水平，添加5％的CSP分別使ApoE-/-小鼠血清TC和LDL-C降低了14％和21.2％；添加10％的CSP分別使ApoE-/-鼠血清TC和LDL-C降低了17.3％和46.6％，而且還觀察到了TG有36.6％的

11、下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明重組的木瓜復(fù)合抗氧化物具有降低誘發(fā)AS相關(guān)血脂指標(biāo)水平的作用，特別是降低主要風(fēng)險(xiǎn)因素--LDL-C的血清濃度。 2)木瓜復(fù)合抗氧化物顯著提高了血清抗氧化的能力。對(duì)比Control組的血清抗氧化指標(biāo)，添加5％的CSP分別使ApoE-/-小鼠血清GSH-Px和T-AOC提高了30％和53.3％；添加10％的CSP分別使ApoE-/-小鼠血清GSH-Px和T-AOC提高了47.1％和126.7％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重

12、組的復(fù)合木瓜抗氧化物不僅在體外FRAP、SOD和TAC抗氧化指標(biāo)上表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化特性，還在體內(nèi)發(fā)揮出了提高血清抗氧化能力的生物學(xué)抗氧化效應(yīng)，這對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因子--ox-LDL的生成有潛在地抑制作用。 3)木瓜復(fù)合抗氧化物顯著下調(diào)了ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇斑塊中TNF-α的表達(dá)。以Control組主動(dòng)脈斑塊中TNF-α評(píng)分結(jié)果為基準(zhǔn)，添加5％、10％的CSP使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇TNF-α分值分別降低了19

13、％和67％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組的木瓜復(fù)合抗氧化物具有抗炎生物學(xué)效應(yīng)，這對(duì)由炎性因子介導(dǎo)的AS發(fā)生發(fā)展效應(yīng)有潛在的抑制作用。 4)木瓜復(fù)合抗氧化物顯著下調(diào)了ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部CD68的表達(dá)水平和減少了巨噬細(xì)胞數(shù)。以Control組免疫熒光結(jié)果為基準(zhǔn)，添加5％、10％的CSP分別使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68表達(dá)水平下調(diào)了25.1％和38.3％；添加5％、10％的CSP分別使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部

14、巨噬細(xì)胞數(shù)減少了42.8％和50.3％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組的木瓜復(fù)合抗氧化物對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的AS促發(fā)效應(yīng)有潛在的抑制作用。 5)通過(guò)電鏡掃描觀察，ApoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀械湫偷腁S發(fā)生發(fā)展表征，如脂質(zhì)沉積引發(fā)了血管壁表面微觀結(jié)構(gòu)的變化，表現(xiàn)為內(nèi)膜紋理走向紊亂、表面有“蟲(chóng)蝕”樣、間隙增大，血管壁向管腔隆起增厚和血小板凝集變形沉積在管壁上。這些都與本實(shí)驗(yàn)探究的血脂異常、炎性因子水平、巨噬細(xì)胞數(shù)和機(jī)體抗氧化狀態(tài)有密切聯(lián)系和相關(guān)性。

15、 7.重組的木瓜復(fù)合抗氧化物比發(fā)揮相似抗AS效應(yīng)的茶粉添加來(lái)說(shuō)，對(duì)ApoE-/-小鼠生長(zhǎng)影響更小，干預(yù)過(guò)程更安全；重組的木瓜復(fù)合抗氧化顆粒比單一維生素C添加對(duì)ApoE-/-小鼠的AS防治更有效。 綜上所述，本研究通過(guò)酶解提取、包合修飾和噴霧制粒技術(shù)將木瓜中的抗氧化組分成功地、較完整地重組到了環(huán)糊精給藥載體上，制備成了具有良好儲(chǔ)藏特性的木瓜復(fù)合抗氧化顆粒，其含有豐富的維生素C、多酚類物質(zhì)，具有清除超氧陰離子、脂質(zhì)自由基和鐵

16、離子還原能力；通過(guò).ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)了重組的木瓜復(fù)合抗氧化物具有防治動(dòng)脈粥樣硬化的功效，主要體現(xiàn)為減少降主動(dòng)脈內(nèi)壁脂質(zhì)沉積、抑制主動(dòng)脈弓中內(nèi)膜厚度的增加、抑制主動(dòng)脈竇斑塊的增長(zhǎng)。其可能的機(jī)制是木瓜抗氧化物通過(guò)降低血清TG、TC和LDL-C的濃度水平、提高機(jī)體抗氧化能力從而抑制LDL的氧化程度、降低炎性因子的表達(dá)及炎性細(xì)胞的數(shù)量發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)還通過(guò)對(duì)比研究添加超微綠茶粉和維生素C對(duì)Apo

17、E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的防治功效，證實(shí)了含有總酚量相近的超微綠茶粉在很多生物學(xué)效應(yīng)上與添加木瓜復(fù)合抗氧化物的低劑量組一致，從一個(gè)側(cè)面證實(shí)了木瓜復(fù)合抗氧化物中的多酚類物質(zhì)與目前研究公認(rèn)的防心血管疾病茶多酚類物質(zhì)，具有同樣的生物學(xué)抗氧化功能及抗AS功效，而達(dá)到等效的抗AS效應(yīng)，添加的茶粉影響了小鼠的體重增加；同時(shí)，與木瓜復(fù)合抗氧化物高劑量組添加有等量維生素C的單一純維生素C添加組，并未顯現(xiàn)出抗AS的生物學(xué)效應(yīng)。因此，茶粉和維生素C的干預(yù)對(duì)

18、比研究證明了重組木瓜抗氧化物在抗ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化方面安全性更高、功效性更強(qiáng)。因此，本研究從木瓜抗氧化組分的重組技術(shù)著手，首先獲得抗氧化物含量高、組分完整、穩(wěn)定性強(qiáng)和生物利用率高的重組木瓜抗氧化物，然后添加入飼料中使動(dòng)物以自然飲食方式進(jìn)行補(bǔ)充，評(píng)價(jià)和探討其對(duì)氧化損傷相關(guān)疾病--動(dòng)脈粥樣硬化的防治效應(yīng)和機(jī)制，這不僅發(fā)揮了木瓜天然存在的抗氧化組分的復(fù)合抗氧化、抗炎癥效應(yīng)，從而具有抗AS生物學(xué)效應(yīng)，還為后期推廣到人群應(yīng)用提供了實(shí)用