殼寡糖對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化影響及其機制的研究.pdf

1、目的：所在課題組既往研究證明，甲殼類動物外骨骼及真菌細胞壁等的主要成分幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物殼寡糖(chitosan-oligosaccharides，COS)具有明確的改善血脂并促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運作用，但對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成的影響尚無文獻報道。本研究以自發(fā)AS的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，apoE-/-)小鼠為模型并采用高脂肪高膽固醇飼料誘導AS斑塊形成，

2、觀察COS對AS損傷的影響，并對其機制進行分析；為進一步驗證其機制，檢測不同劑量的COS在體外模型對膽固醇代謝相關(guān)基因表達的影響。
　　 方法：⑴本實驗選用12周齡雄性apoE-/-小鼠35只，隨機分為3組：模型組(Model組，n=11)，給予滅菌蒸餾水；COS低劑量組(COS-L組，n=12)，給予COS劑量為250mg/kg；(3)COS高劑量組(COS-H組，n=12)，給予COS劑量為1000mg/kg。每天固定時間灌

3、胃，體積為0.01L/kg，同時給予高脂肪高膽固醇飲食(含15.8％脂肪和1.25％膽固醇)喂養(yǎng)12周，自由飲水，12h亮/12h暗光照循環(huán)。⑵灌胃第12周末，禁食12小時后，麻醉，內(nèi)眥靜脈取血，分離血漿檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)，通過快速蛋白液相色譜(Fas

4、t protein liquidchromatography，F(xiàn)PLC)分析血漿脂質(zhì)譜，蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot)技術(shù)檢測血漿載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)含量。⑶解剖分離小鼠主動脈，剖開內(nèi)膜后進行油紅O染色，同時主動脈根部連續(xù)冰凍切片后也行油紅O染色，采集圖像并應(yīng)用Image-Pro Plus6.0 software統(tǒng)計主動脈內(nèi)膜和主動脈根部斑塊面積，分別請兩位觀察者以隨機、雙盲方式評估動脈

5、粥樣硬化損傷程度。⑷免疫組化法檢測COS處理組與對照組主動脈根部冰凍切片斑塊部位的巨噬細胞含量和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的含量差異。⑸酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測小鼠血漿白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量。⑹實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)技術(shù)和Western B

6、lot技術(shù)檢測肝臟和腹腔巨噬細胞與膽固醇代謝相關(guān)基因的表達：三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運子A1和G1(ATP-binding cassette transporters A1 and G1，ABCA1 and ABCG1)、低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)、清道夫受體BI(scavenger receptor BI，SR-BI)等。⑺為進一步明確COS對膽固醇代謝相關(guān)基因的作用，

7、采用不同濃度的COS干預(yù)肝細胞模型HepG2細胞和巨噬細胞模型RAW264.7細胞，檢測上述與膽固醇代謝相關(guān)的基因mRNA表達。
　　 結(jié)果：①COS明顯改善血漿脂蛋白的脂質(zhì)和蛋白表型：COS-L組和COS-H組TC分別比Model組低11％(P<0.05)和23％(P<0.01)；血漿TG顯著改善，COS-L和COS-H分別比Model組低29％(P<0.05)和31％(P<0.01)，而HDL-C的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.

8、05)；在COS組，非-HDL顆粒上的膽固醇(Non-HDL-C)和TG明顯低于Model組；COS-H組血漿載脂蛋白B100(apolipoprotein B，apoB100)比Model組低56％(P<0.05)。②COS可劑量依賴地減輕AS：主動脈內(nèi)膜損傷面積統(tǒng)計表明，COS-L組和COS-H組分別較Model組低27.6％(P<0.05)和33.3％(P<0.01)；主動脈根部斑塊面積統(tǒng)計表明，COS-L組和COS-H組分別較M

9、odel組低30.4％(P<0.05)和54.3％(P<0.01)。③COS可減少主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞含量，與Model組相比，COS-L組主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞含量低32％(P<0.01)，COS-H組低55％(P<0.01)；COS各組斑塊部位MMP-9含量與Model組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。④COS處理組血漿IL-6、TNF-α水平較Model組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。⑤COS可促進apoE-/-鼠肝臟

10、LDL-R和SR-BI的mRNA和蛋白表達；COS可明顯促進apoE-/-小鼠外周巨噬細胞ABCA1和SR-BI的mRNA和蛋白表達。⑥COS可增加HepG2細胞SR-BI、LDL-R mRNA水平的表達以及RAW264.7細胞ABCA1 mRNA水平的表達。
　　 結(jié)論：⑴COS能減輕高脂飼料誘導的apoE-/-小鼠AS損傷；⑵COS減輕apoE-/-小鼠AS損傷的可能機制有：COS降低apoE-/-小鼠血漿Non-HDL的膽