定心方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化及內(nèi)臟脂肪素表達的研究.pdf

1、一、背景
　　 自20世紀(jì)80年代以來，隨著我國人民物質(zhì)生活水平的提高，生活方式的改變，隨著中國人口正在逐步邁入老齡化進程，加上肥胖人群及代謝綜合征發(fā)病率的增高，冠心病已成為我國最常見的心血管病病種，成為危害我國人民健康的嚴重公共衛(wèi)生問題。冠心病的主要病理基礎(chǔ)是由血細胞、紊亂血流和血管壁之間的動態(tài)相互作用結(jié)果形成的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，而AS的具體發(fā)病機制至今尚未明確，研究者們先后提出脂質(zhì)浸潤學(xué)說

2、、動脈平滑肌細胞增殖學(xué)說、受體缺失學(xué)說、血栓源性學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說等假說，隨著對動脈粥樣硬化研究的不斷深入，人們逐漸認識到炎癥是AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素。早在上世紀(jì)末Ross就提出AS是一種炎癥性疾病，越來越多的研究證實炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且貫穿于AS斑塊的形成、生長到最后斑塊表面破裂并發(fā)血栓形成的所有階段。AS斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)促使不穩(wěn)定斑塊的形成和破裂，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生細胞成分的活化并介導(dǎo)血栓形成，是大多數(shù)

3、急性冠脈綜合征發(fā)生的中心啟動環(huán)節(jié)。AS代表了慢性炎癥過程，系統(tǒng)性抑制炎癥過程可能是治療冠心病的關(guān)鍵。
　　 內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)與炎癥和代謝綜合征有關(guān)的脂肪組織分泌的細胞因子， Visfatin與以往在淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的一種稱為“前B細胞集落增強因子”(pre-B cell colony-enhancing factor，PBEF)的免疫系統(tǒng)蛋白為同一物質(zhì)。Visfatin具有多種生物學(xué)活性，如模擬胰島

4、素樣活性、增加胰島素敏感性、參與炎癥反應(yīng)應(yīng)答、誘導(dǎo)血管生成、延緩中性粒細胞凋亡、調(diào)節(jié)脂代謝等。雖然目前Visfatin在體內(nèi)的具體作用及作用機理尚未深入研究，但它的發(fā)現(xiàn)為研究糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病等相關(guān)疾病的發(fā)病機制、早期診斷及治療提供了新的思路。
　　 研究發(fā)現(xiàn)血漿Visfatin水平與血管內(nèi)皮細胞功能在2型糖尿病患者中呈顯著負相關(guān)，而血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的起始環(huán)節(jié)之一。血漿Visfatin在代謝綜合征患者中顯著升高

5、，而在伴有頸動脈粥樣硬化的患者其升高更為明顯。Visfatin在不伴有肥胖、糖尿病等代謝性疾病的冠心病患者中，水平同樣也升高。冠心病患者的血漿Visfatin水平顯著升高，特別是急性冠脈綜合癥患者升高更為明顯，Visfatin是獨立于既往已知冠心病危險因素的又一新的危險因素。通過病例對照研究得到了相同的結(jié)論，病例組的血漿Visfatin濃度顯著高于對照組，并且Visfatin與高敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-rea

6、ctive protein，hs-CRP)呈顯著正相關(guān)，多元回歸分析證實血漿Visfatin是心肌缺血性發(fā)作的獨立危險因素。有臨床研究顯示，冠心病患者血漿的Visfatin的升高伴有單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、hs-CRP等炎癥介質(zhì)的升高，進行體外細胞水平實驗得到類似的結(jié)論。此外，Visfatin可以增強單核細胞

7、株中單核細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及外周血單核細胞中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達。以上研究表明，Visfatin可能在AS炎癥反應(yīng)過程中扮演了重要角色。
　　 C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是各種急性組織損傷、感染及其他各種炎

8、癥刺激的急性期反應(yīng)蛋白，不穩(wěn)定心絞痛患者可通過檢測血漿CRP濃度判斷愈后。通過檢測不穩(wěn)定型心絞痛病人血漿CRP，結(jié)果顯示CRP＞3μg/ml的患者存活率顯著低于CRP＜3μg/ml的患者。對于穩(wěn)定型心絞痛病人，經(jīng)行冠狀動脈支架植入術(shù)72小時后測量血漿CRP水平，并開展持續(xù)1年的隨訪檢測，結(jié)果顯示CRP＜5μg/ml的患者存活率明顯高于CRP＞5μg/ml的患者。始于上世紀(jì)末的“醫(yī)師健康研究”是一項具有里程碑意義前瞻性研究成果，它主要通過

9、檢測健康個體中CRP濃度預(yù)測未來心血管疾病事件發(fā)生的危險性。該項實驗通過檢測1086名成年健康男性的基礎(chǔ)CRP水平，并開展持續(xù)8年的隨訪監(jiān)測，其中CRP水平較高543名男性后來發(fā)展為心肌梗塞、中風(fēng)及靜脈栓塞等心血管疾病，另543名男性沒有心血管疾病事件的報告。此后對絕經(jīng)期婦女進行了前瞻性研究，同時比較了其它的炎癥標(biāo)志物，如血清淀粉樣P成分(serum amyloidPcomponent，SAP)、白介素-26(interleukin-2

10、6，IL-26)、細胞間黏附分子-21(intercellular adhesion molecule-21，sICAM21)等，發(fā)現(xiàn)CRP是最強有力的心血管病危險的預(yù)示標(biāo)志物。近年來CRP已被作為一種冠心病的獨立預(yù)測指標(biāo)，美國心臟病協(xié)會達成以CRP作為測定心血管疾病危險性指標(biāo)的共識。
　　 TNF-α是炎癥因子家族中較活躍，并較容易在外周循環(huán)中測得的細胞因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，主要參與炎癥反應(yīng)的級聯(lián)過程。TNF-α可以通過直

11、接介導(dǎo)T淋巴細胞粘附、遷移，并積聚在受累內(nèi)皮下，形成內(nèi)皮功能障礙，促進血管平滑肌細胞的增殖，使內(nèi)皮正常平衡調(diào)節(jié)作用改變。TNF-α也能誘導(dǎo)血小板黏附，增強白細胞的趨化作用，促進凝血、抑制纖溶、促進單核細胞對內(nèi)皮細胞的粘附以及降低血管平滑肌細胞活性等作用，持續(xù)炎癥反應(yīng)過程，刺激平滑肌遷移和炎癥細胞交織，形成AS斑塊。同時TNF-α能抑制血管平滑肌細胞表達間質(zhì)基因，是纖維帽變薄弱和平滑肌增生能力降低增加斑塊的易損性。在急性冠脈綜合癥患者的抗

12、炎治療中發(fā)現(xiàn)抗炎藥物都可以降低TNF-α的水平，血漿TNF-α水平與早期動脈粥樣硬化的程度相關(guān)，提示TNF-α產(chǎn)生增加是動脈粥樣硬化形成的一種早期而且重要的事件，人們認為炎性細胞因子TNF-α可作為將來心血管事件發(fā)生的危險因素和預(yù)測因子。
　　 中醫(yī)藥防治冠心病療效確切，中醫(yī)藥對抗動脈粥樣硬化的作用機制具有多層次、多角度、多靶點的特征，其中抗炎是重要的機制之一。很多中醫(yī)學(xué)者認為，從中醫(yī)病因病機理論角度來看，AS具有“氣虛、血瘀、

13、痰濕”的特點，益氣活血祛痰應(yīng)是中醫(yī)藥防治AS主要方法之一。定心方是我校附屬南方醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科經(jīng)驗方，由丹參、三七、赤芍、瓜蔞、茯苓、黨參、靈芝、酸棗仁、苦參、黃連等組成，具有益氣活血祛痰燥濕之功效，臨床研究證明其對冠心病有良好的療效。前期實驗表明，定心方對缺血及再灌注損傷有良好的保護作用，其作用機制與降低核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、TNF-α、細胞間黏附分子-1(intercellular a

14、dhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥介質(zhì)有關(guān)。
　　 二、目的
　　 本實驗采用ApoE基因敲除小鼠加上高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制AS動物模型，用定心方對ApoE基因敲除小鼠AS模型進行干預(yù)，監(jiān)測在AS發(fā)展過程中Visfatin在血清和組織的蛋白表達，以了解Visfatin在AS中的作用。觀察定心方對AS斑塊的影響和對Visfatin及炎癥因子CRP、TNF-α表達的干預(yù)作用，為AS的預(yù)防和治療提供新的思路。

15、
　　 三、方法
　　 8周齡C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，隨機分為5組，每組7只。分別為模型組，辛伐他汀組，定心方低劑量組，定心方中劑量組，定心方高劑量組，并以7只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白對照組，所有小鼠均高脂飼料喂養(yǎng)。定心方低劑量組定心方藥液灌胃9.30g/kg，每日一次;定心方中劑量組定心方藥液灌胃18.59 g/kg，每日一次;定心方高劑量組定心方藥液灌胃37.18

16、g/kg，每日一次;辛伐他汀組辛伐他汀藥液灌胃5 mg/kg，每日一次，其他組給予等劑量生理鹽水灌胃。各組小鼠自由飲水，根據(jù)小鼠體質(zhì)量（每周測量1次），以校正給藥量，12周后停止藥物干預(yù)，結(jié)束實驗。
　　 腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，行心臟灌注，自主動脈根部至腹主動脈末端分離整條主動脈，一部分放入4％多聚甲醛中固定，一部分放入液氮中保存。
　　 主動脈組織常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色觀察主動脈組織病理學(xué)改變

17、，計算各組斑塊面積百分比。分離的血清，檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)含量。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中Visfatin、CRP、TNF-α的表達，觀察定心方對ApoE-/-小鼠AS模型中血清Visfatin、CRP

18、、TNF-α的影響。主動脈組織提取蛋白，進行蛋白印跡實驗，觀察Visfatin表達的變化及定心方對其表達的影響。
　　 實驗數(shù)據(jù)屬于完全隨機設(shè)計的計量資料，故采用單因素方差one-wayANOVA進行方差分析，方差齊時采用LSD法進行組間多重比較，方差不齊時采用Dunnett's T3法進行組間多重比較，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，變量間的相關(guān)的因素采用逐步多元直線回歸分析，P＜0.05為有顯著性差異。采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)

19、的統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 四、結(jié)果
　　 1.定心方對ApoE-/-小鼠體重及生長情況的影響實驗結(jié)束后稱量體重，各組小鼠實驗結(jié)束時體重均有一定的增加?？瞻讓φ战M、模型組、辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組體重增加值分別為(3.83±0.93)g、(7.70±1.01)g、(6.87±0.82)g、(4.97±0.58)g、(4.87±0.70)g、(4.61±0.49)g，各間組小鼠體重增加值有顯著差

20、異（F=25.379，P=0.000）。各給藥組體重增加值均低于模型組，其中定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組體重增加值與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;定心方高劑量組與定心方中劑量組、定心方低劑量組體重增加值無顯著差異（P＞0.05）;辛伐他汀組體重增加值與模型組相比無顯著性差異(P=0.054)。對各組小鼠的攝食情況觀察表明，各組小鼠攝食和飲水均正常。模型組小鼠毛色普遍缺乏光澤度，活動較差，排泄尚正常。辛伐他汀組

21、、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量小鼠的生長情況較模型組有所改善。
　　 2.各組小鼠血脂各項指標(biāo)的變化對各組小鼠血清脂質(zhì)水平測定表明，模型組血脂水平顯著高于空白對照組（P＜0.01），各給藥組血清TC、TG、HDL、LDL水平均低于模型組。與模型組相比，定心方高劑量組、辛伐他汀組血清TC、TG、HDL、LDL顯著降低(P＜0.05)，兩組組間比較比較無顯著差異（P＞0.05）。定心方高劑量組血脂水平低于定心方低、中

22、劑量組，其中TG水平顯著降低(P＜0.01)。
　　 3.定心方對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊病變病理觀察病理觀察可見空白對照組主動脈內(nèi)膜光滑完整，主動脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜及外膜結(jié)構(gòu)清晰，未見脂質(zhì)條紋或纖維斑塊。模型組主動脈管壁厚薄不均，可見大量充滿脂質(zhì)的泡沫細胞及膽固醇結(jié)晶裂隙的粥樣斑塊病灶，斑塊體積較大，其中脂質(zhì)核心較大，融合成片，內(nèi)膜廣泛而明顯的纖維化、增厚，血管壁向管腔內(nèi)突出，中膜平滑肌明顯萎縮變薄，外膜可見

23、結(jié)締組織增生及炎細胞、漿細胞浸潤，血管內(nèi)彈力膜圍繞面積明顯比空白對照組增大。各給藥組間小鼠主動脈根部粥樣斑塊面積百分比有顯著差異（F=290.316，P=0.000）。與模型組比較，各給藥組小鼠主動脈根部AS病變得以不同程度的控制，其中定心方低劑量組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)的脂質(zhì)中心面積相對變小，纖維帽較厚;辛伐他汀、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠主動脈根部斑塊面積百分比明顯減小。模型組與辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠主

24、動脈根部粥樣斑塊面積百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;定心方低劑量組與模型組主動脈根部動脈粥樣斑塊面積百分比之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.849);定心方高劑量組與定心方中劑量組主動脈根部動脈粥樣斑塊面積百分比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）;定心方高劑量組與辛伐他汀組主動脈根部動脈粥樣斑塊面積百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)。定心方各給藥組從對AS病變的抑制效果呈量效關(guān)系。
　　 4.定心方對ApoE-/-小

25、鼠血清CRP水平的影響各組間小鼠血清CRP水平有顯著差異（F=238.171，P=0.000）。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠血清CRP水平明顯增高(P=0.000)。辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清CRP水平顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。定心方高劑量組CRP水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組小鼠血清CRP水平低于辛伐他汀組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理兩

26、組間差異無顯著性(P=0.635)。
　　 5.定心方對ApoE-/-小鼠血清TNF-α水平的影響各組間小鼠血清TNF-α水平有顯著差異（F=288.101，P=0.000）。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠血清TNF-α水平明顯增高(=0.000)。辛伐他汀組、定心方低劑量組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清TNF-α水平顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。定心方高劑量組TNF-α水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組，

27、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組小鼠血清TNF-α水平高于辛伐他汀組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理兩組間差異無顯著性(P=0.998)。
　　 6.Western blot檢測各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中Visfatin蛋白表達通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，各組間主動脈組織中Visfatin蛋白的表達有顯著性差異（F=201.400，P=0.000）。與空白組相比，模型組主動脈組織Visfatin的表達較空白對照組顯著

28、升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.000）;辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組主動脈組織Visfatin水平與模型組相比有所降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;定心方高劑量組Visfatin水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組（P＜0.05）），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;辛伐他汀組與定心方高劑量組主動脈組織Visfatin的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.869）。
　　 7.定心方對ApoE-/-小鼠血清Visfatin

29、水平的影響檢測ApoE-/-小鼠血清中Visfatin水平，各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=373.845，P=0.000）。模型組小鼠血清Visfatin含量較空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);辛伐他汀組、定心方中劑量組、定心方高劑量組小鼠血清Visfatin含量低于模型組(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;定心方高劑量組血清Visfatin水平低于定心方低劑量組、定心方中劑量組（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

30、;定心方高劑量組與辛伐他汀組小鼠血清Visfatin含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.793）。
　　 8.ApoE-/-小鼠血清和組織Visfatin表達與血清CRP、TNF-α水平的相關(guān)性分析逐步多元直線回歸分析顯示ApoE-/-小鼠血清Visfatin水平與血清CRP水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義（R2=0.893，F(xiàn)=334.545，p=0.000）;血清Visfatin水平與血清TNF-α水平的相關(guān)關(guān)系不具有統(tǒng)計

31、學(xué)意義（P=0.174）。ApoE-/-小鼠主動脈組織Visfatin表達與血清TNF-α水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義（R2=0.856，F(xiàn)=95.352，P=0.000）;主動脈組織Visfatin表達與血清與血清CRP水平的相關(guān)關(guān)系不具有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.181）。
　　 五、結(jié)論
　　 1.不同劑量定心方均可減輕ApoE-/-小鼠主動脈病理病變，定心方高劑量組管腔狹窄程度明顯減輕，斑塊較小，優(yōu)于辛伐他

32、汀組。
　　 2.不同劑量定心方均可明顯減輕AS病程中ApoE-/-小鼠體重增加值，定心方給藥組ApoE-/-小鼠血脂水平顯著下降，說明定心方對ApoE基因缺陷小鼠有降脂和減肥作用，延緩了AS進展。
　　 3.模型組小鼠血清CRP、TNF-α水平、血脂水平較空白對照組小鼠明顯增高，而高劑量定心方治療后血清CRP、TNF-α水平及血脂水平顯著下降，并顯示出比對照藥辛伐他汀更為突出的效果，證實了定心方對AS的抑制作用，定心方

33、可能通過減輕ApoE-/-小鼠炎癥反應(yīng)而起到抗AS及穩(wěn)定斑塊的作用。
　　 4.Visfatin在模型組小鼠血清和組織中高表達，進一步證實了Visfatin與AS之間存在明確的相關(guān)性，其可能參與了AS的發(fā)生發(fā)展。ApoE-/-小鼠的血清中的Visfatin與血清CRP存在顯著正相關(guān)關(guān)系，主動脈組織中的Visfatin與血清TNF-α水平存在顯著正相關(guān)關(guān)系，提示Visfatin參與炎癥應(yīng)答。
　　 5.中、高劑量定心方治療