抑制RAGE和galectin-3對apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，系統(tǒng)性和/或局部的炎癥參與了從動脈粥樣硬化起始到斑塊破裂的全過程。致動脈粥樣硬化的眾多因素例如氧化應(yīng)激、晚期糖基化終產(chǎn)物、高血壓和吸煙等都可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而加速脂質(zhì)的血管沉積、單核細(xì)胞向受損內(nèi)皮遷徙黏附并進(jìn)入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞的聚集是動脈粥樣硬化啟動的重要環(huán)節(jié)，單核細(xì)胞可釋放多種前炎癥因子如：ICAM-1、VCAM-1、MCP-1和ILs等以促進(jìn)其分化為巨噬細(xì)胞?；罨木奘杉?xì)胞可分泌

2、多種炎癥因子放大炎癥反應(yīng)，加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展。巨噬細(xì)胞還可分泌多種蛋白降解酶類如膠原酶和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶等，從而降解纖維帽中膠原成分，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定甚至破裂，最終產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床后果如心肌梗死和腦梗塞等。
　　 晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptorofadvancedglycationendproducts，RAGE)參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程。RAGE可通過調(diào)控ERK1/2、JNK和p38MAPK等信號傳導(dǎo)通路誘

3、導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1和MCP-1及MMP-2和9的表達(dá)。RAGE還可以以下途徑參與和放大炎癥反應(yīng)過程。一方面，RAGE和其配體結(jié)合活化后可通過刺激NF-κBP65的表達(dá)而持續(xù)增強NF-KB活性，進(jìn)一步上調(diào)黏附、趨化因子及MMP-2和9的表達(dá)。另一方面，RAGE通過刺激產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)直接活化NF-κB通路。此外，RAGE的表達(dá)也受到ROS和NF-κB的調(diào)控。因此，抗氧化劑有可能通過

4、抑制RAGE和NF-κB的活性減輕炎癥反應(yīng)并抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展。既往的研究提示，AMPK激動劑WS070117和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)均具有抗氧化活性，但尚不清楚這兩種抗氧化劑是否具有抑制RAGE及其相關(guān)信號通路的作用。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞上的多種粘附因子如VCAM-1、ICAM-1等介導(dǎo)了單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，單核細(xì)胞與內(nèi)皮下的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatri

5、x，ECM)如層粘連蛋白、玻連蛋白、膠原Ⅰ和Ⅳ等相互作用而“錨定”在ECM，并分化為巨噬細(xì)胞。既往的研究證明，galectin-3參與了多種遷徙細(xì)胞（如多種腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞）與內(nèi)皮之間的粘附，數(shù)種基質(zhì)參與其中。首先，多種ECM成分如層粘連蛋白、纖連蛋白，MAC-2結(jié)合蛋白等可作為galectin-3的配體與其結(jié)合。其次，galectin-3作用于單核/巨噬細(xì)胞表面的CD98，活化一系列信號通路并與整聯(lián)蛋白結(jié)合。整聯(lián)蛋白尤其是αMp2與g

6、alectin-3結(jié)合后，直接促進(jìn)巨噬細(xì)胞定位于內(nèi)皮下的ECM。前期的實驗發(fā)現(xiàn)，可特異性結(jié)合galectin-3糖識別結(jié)合結(jié)構(gòu)域的改良的柑橘果膠(modifiedcitruspectin，MCP)可抑制多種腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。但MCP是否也能抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合至今尚未見報道。
　　 本論文主要分為兩個部分：第一部分研究AMPK激動劑WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用，側(cè)重探討WS0

7、70117和NAC的抗氧化特性以及對NF-κB、RAGE及其相關(guān)信號通路的抑制作用。第二部分研究galectin-3抑制劑MCP在apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用。
　　 第一部分：
　　 AMPK激動劑WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用
　　 目的：WS070117是一種新合成的AMPK激動劑，具有抗氧化的特性。我們分別用WS070117和NAC處理apoE-/-小鼠。

8、探討WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用及其機(jī)制。
　　 實驗設(shè)計及方法：以高脂飼料喂養(yǎng)30只10周齡雄性apoE-/-小鼠8周，建立動脈粥樣硬化動物模型，同步給與WS070117和NAC藥物干預(yù)以觀察對動脈粥樣硬化的影響。以葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，TBA法測定血脂濃度，病理學(xué)染色和免疫組化法分析斑塊內(nèi)細(xì)胞成分及炎癥因子的含量變化，DHE熒光染色法檢測斑塊內(nèi)ROS的生成，用Westernblot

9、檢測RAGE、p38MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化水平以及下游的黏附趨化因子MCP-1、VCAM-1和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：WS070117和NAC對apoE-/-小鼠的血糖和血脂均無明顯的影響，WS070117減少頭臂干斑塊的大小和斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞量。NAC也減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量并顯著增加斑塊內(nèi)膠原成分含量，但是對斑塊大小無明顯的影響。Westemblot的結(jié)果

10、顯示，WS070117和NAC均抑制NF-κB活性相關(guān)蛋白和RAGE的表達(dá)及ERK1/2、p38MAPK、JNK的磷酸化水平，也降低VCAM-1、MCP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：我們的結(jié)果表明，WS070117和NAC可通過抑制NF-κB活性和RAGE及其相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)或激活以抑制多種黏附、趨化因子或MMPs的表達(dá)，從而抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展。
　　 第二部分：
　　 Gale

11、ctin-3配體特異性競爭抑制劑——改良的柑橘果膠抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展
　　 目的：我們給予apoE-/-小鼠Galectin-3特異性抑制劑--改良的柑橘果膠(modifiedcitruspectin，MCP)處理，觀察頭臂干部位動脈粥樣硬化斑塊的變化，探討Galectin-3在動脈粥樣硬化起始中的作用以及MCP對動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的影響。
　　 實驗設(shè)計及方法：以高脂飼料喂養(yǎng)12只8周齡雄性apoE-/-

12、小鼠，分別口服1％MCP飲用水8周或10%MCP灌胃4周，以觀察其對動脈粥樣硬化進(jìn)展的影響。以葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，TBA法測定血脂濃度，病理學(xué)染色和免疫組化法分析斑塊大小及其內(nèi)容物的變化。
　　 結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果顯示，MCP干預(yù)后apoE-/-小鼠頭臂干部位的動脈粥樣硬化斑塊大小和斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量均降低。
　　 結(jié)論：我們的結(jié)果表明，在動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展過程中，Galectin-3可能參與了內(nèi)皮細(xì)胞