EMMPRIN單克隆抗體抑制ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　冠心病在2013年最新公布的全世界死亡原因排名中再次高居首位。而急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndromeACS)是冠心病致死率高的重要疾病類型。臨床證據(jù)和病理學(xué)研究均表明，ACS發(fā)病的病理機(jī)制為動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂。炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑能夠加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展;細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinasesMMPs)活性升高帶來的過度的細(xì)胞外基質(zhì)

2、的降解則是動脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)定轉(zhuǎn)變成為易損斑塊的重要原因。易損斑塊在病理上表現(xiàn)為富集巨噬-泡沫細(xì)胞的較大的脂質(zhì)核心，以及較薄的纖維帽缺乏足夠的平滑肌細(xì)胞保護(hù)。目前認(rèn)為如果能夠防止易損斑塊的破裂從而減少血栓形成機(jī)率，冠狀動脈粥樣硬化疾病是一個相對良性的疾病。所以，延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展、穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊是冠心病防治的關(guān)鍵。
　　細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Extracellularmatrixmetalloprotein

3、aseinducerEMMPRIN)，首先發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞表面，能夠增強(qiáng)MMPs的表達(dá)并促使腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤。屬于免疫球蛋白超家族成員之一。30余年對EMMPRIN的研究發(fā)現(xiàn)這一蛋白不僅參與了視網(wǎng)膜、精子的形成以及免疫、神經(jīng)生理反應(yīng)，還參與腫瘤遷移、浸潤以及親環(huán)蛋白介導(dǎo)的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)EMMPRIN在動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞以及人類動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)高表達(dá)，2002年發(fā)現(xiàn)EMMPRIN在動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)并參與了動脈粥樣

4、硬化病變的發(fā)展，2005年有學(xué)者又用氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞中同樣高表達(dá)EMMPRIN。越來越多的證據(jù)表明EMMPRIN參與了易損斑塊破裂。EMMPRIN能夠表達(dá)于多種細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板等血管活性細(xì)胞表面，作為細(xì)胞表面受體與親環(huán)蛋白、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、整合素以及EMMPRIN本身結(jié)合，引起下游的包括誘導(dǎo)MMPs表達(dá)、氧化應(yīng)激等多種信號途徑。
　　MMPs參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成

5、及失穩(wěn)定性過程。雖然MMPs種類多，對MMPs的報(bào)道仍存在爭議，但MMPs作為潛在的抗動脈粥樣硬化因子一直廣受關(guān)注。由于MMPs直接抑制劑效果不佳，所以對MMPs的上游的調(diào)節(jié)顯得更為重要。EMMPRIN能夠調(diào)節(jié)多種MMPs的從頭合成，使EMMPRIN進(jìn)入了動脈粥樣硬化斑塊的研究領(lǐng)域。從2002年Major等發(fā)現(xiàn)EMMPRIN表達(dá)于動脈粥樣硬化斑塊表面以后，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EMMPRIN參與了泡沫細(xì)胞形成、血小板激活以及促炎癥因子分泌信號途徑

6、。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣斑塊內(nèi)的主要效應(yīng)細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均有不同程度的MMPs表達(dá)變化，并與EMMPRIN的下游促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EMMPRIN可高表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞表面及APOE-/-小鼠動脈粥樣斑塊內(nèi)，參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RASSystem)作用及MMP-9表達(dá)調(diào)控;并與動脈粥樣硬化過程中重要的炎癥信號因子(Nuclearfactor-kappaBNF-κ

7、B)、環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase2COX-2)及前列腺素E2(prostaglandinE2PGE2)關(guān)系密切。以上研究高度提示MMPs共同的上游分子EMMPRIN可能通過某些途徑影響動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性。
　　國內(nèi)外已有研究者針對EMMPRIN的作用原理使用EMMPRIN單克隆抗體在動物模型有效預(yù)防和治療風(fēng)濕病和哮喘等疾病。據(jù)此我們推斷EMMPRIN單克隆抗體也可能影響動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展及穩(wěn)定性。本課題擬建立動

8、脈粥樣硬化小鼠模型，采用EMMPRIN單克隆抗體進(jìn)行干預(yù)，研究其對動脈粥樣硬化斑塊的影響及內(nèi)在機(jī)制。
　　方法
　　1.12只ApoE-/-小鼠，8-10周齡，體重18-25g，購自北京大學(xué)動物中心。小鼠顆粒飼料購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，主要配方為常規(guī)飼料混合0.15％膽固醇和20％脂肪。分別喂養(yǎng)至12周，取血測定血脂變化情況、取主動脈油紅O染色檢測主動脈斑塊負(fù)荷，鑒定動脈粥樣硬化模型建立情況。Westernblotti

9、ng及組織免疫組化法檢測EMMPRIN表達(dá)情況。
　　2.建立EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)高脂喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠模型。40只ApoE-/-小鼠，8-10周齡，體重18-25g，購自北京大學(xué)動物中心，共分為四組:正常飲食組(n=10)，高脂喂養(yǎng)對照組(n=10)，高脂喂養(yǎng)+EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組(n=10)，高脂喂養(yǎng)+同型對照抗體干預(yù)組(n=10)。高脂飼料配方同前。在高脂喂養(yǎng)12周成功誘導(dǎo)出小鼠動脈粥樣硬化后給予10

10、0ugEMMPRIN及同型對照單克隆抗體8次腹腔注射（4周，每周2次），正常飲食組及高脂喂養(yǎng)對照組給予等量生理鹽水腹腔注射。共喂養(yǎng)16周后到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，處死小鼠，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。
　　3.檢測各組小鼠的血脂、體重。行小鼠主動脈縱軸切面及無名動脈橫切面的油紅O染色。用HE染色檢測無名動脈斑塊形態(tài)，MASSON染色檢測斑塊內(nèi)膠原沉積情況，利用MAC-3、SMC抗體分別標(biāo)記巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞行免疫組織化學(xué)檢測斑塊內(nèi)組織成分，用抗EMMP

11、RIN、親環(huán)素A(CyclophilinACyPA)檢測EMMPRIN、CyPA表達(dá)。
　　4.ELISA的方法研究apoE-/-小鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1變化情況。
　　5.原位明膠酶譜法激光共聚焦檢測小鼠無名動脈斑塊內(nèi)的明膠酶活性，明膠酶譜法檢測小鼠主動脈蛋白勻漿內(nèi)的mmp-2、9活性。
　　6.WesternBlotting法檢測小鼠主動脈EMMPRIN、CyPA蛋白表達(dá)。
　　7.二氫乙啶

12、染色法(DihydroethidiumDHE)檢測無名動脈斑塊上的過氧化酶活性。
　　8.細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測EMMPRIN單克隆抗體對體外raw264.7巨噬細(xì)胞遷移的影響。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用單因析比較(One-wayANOVA)，以P＜0.05為有顯著性差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0軟件。
　　結(jié)果:
　　1.APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型建

13、立及EMMPRIN表達(dá)檢測。
　　①成功建立apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型。
　?、跈z測EMMPRIN在apoE-/-小鼠各喂養(yǎng)時間段表達(dá)變化情況。Westernblotting檢測EMMPRIN在高脂喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠4周、8周、12周表達(dá)較普通飲食喂養(yǎng)組明顯升高，結(jié)果有顯著性差異。免疫組化檢測高脂喂養(yǎng)的4周、8周、12周apoE-/-小鼠主動脈EMMPRIN較普通喂養(yǎng)組明顯升高。
　　2.EMMPRIN單

14、克隆抗體抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的進(jìn)展。
　?、俳Y(jié)果示高脂喂養(yǎng)小組apoE-/-小鼠總膽固醇、甘油三酯、LDL較普通飲食喂養(yǎng)組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EMMPRIN單克隆抗體處理對血脂未產(chǎn)生影響。EMMPRIN單克隆抗體對小鼠體重?zé)o影響。提示EMMPRIN單克隆抗體處理apoE-/-小鼠成功，EMMPRIN單克隆抗體未影響小鼠血脂變化，對小鼠無明顯毒性作用。
　?、贓MMPRIN單克隆抗體減緩了小鼠動脈粥樣硬化的形

15、成。
　　小鼠主動脈縱軸切面油紅O染色結(jié)果顯示:較普通飲食組，高脂組小鼠主動脈斑塊負(fù)荷重;而EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組，損傷部位數(shù)量和面積均顯著減少(P＜0.05)。提示EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)能夠抑制粥樣斑塊形成。無名動脈橫切面的油紅O染色提示脂質(zhì)沉積在EMMPRIN單克隆抗體組明顯減少。本部分結(jié)果提示EMMPRIN單克隆抗體處理減緩了小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　?、跡MMPRIN單克隆抗體改變了動脈粥樣硬化斑

16、塊內(nèi)的組織成分。較高脂喂養(yǎng)組，EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)能夠明顯增加斑塊內(nèi)的膠原量;明顯增加斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞數(shù)目，減少巨噬細(xì)胞數(shù)量。本部分結(jié)果提示EMMPRIN單克隆抗體處理使小鼠動脈粥樣硬化斑塊趨于穩(wěn)定。
　　3.EMMPRIN單克隆抗體抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的進(jìn)展的機(jī)制研究。
　　①EMMPRIN單克隆抗體降低了apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型血清中IL-6、MCP-1含量。以ELISA的方法研究apoE

17、-/-小鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-6、MCP-1變化情況，結(jié)果EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)降低了血清中炎癥因子IL-6、MCP-1的表達(dá)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EMMPRIN單克隆抗體降低了炎癥因子的表達(dá)，可能是減少動脈粥樣硬化斑塊形成的重要因素。
　?、贓MMPRIN單克隆抗體抑制了apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的基質(zhì)金屬蛋白酶活性。斑塊原位明膠酶譜法及主動脈蛋白明膠酶譜法檢測小鼠無名動脈斑塊內(nèi)及主動脈蛋白勻漿內(nèi)的明膠酶活性，結(jié)

18、果均提示EMMPRIN單克隆抗體抑制了小鼠組織的基質(zhì)金屬蛋白酶活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)示單克隆抗體處理后的raw264.7細(xì)胞遷移能力下降。EMMPRIN單克隆抗體降低了基質(zhì)金屬蛋白酶活性，減少了動脈粥樣硬化斑塊膠原降解，降低了巨噬細(xì)胞向動脈粥樣硬化內(nèi)膜遷移的能力。
　　③EMMPRIN單克隆抗體通過CyPA減輕了apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的氧化應(yīng)激反應(yīng)。EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)在沒有減少主動脈CyPA的表達(dá)情況下，減低了C

19、yPA在動脈斑塊中與EMMPRIN的結(jié)合能力。無名動脈斑塊上的過氧化酶DHE檢測顯示EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)后，主動脈斑塊的氧化應(yīng)激明顯減輕。EMMPRIN單克隆抗體阻斷了CyPA與EMMPRIN的結(jié)合，從而減輕了氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能是抑制動脈粥樣硬化斑塊形成、穩(wěn)定斑塊的重要因素。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，發(fā)現(xiàn)EMMPRIN在動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)升高。
　　2.成功建立EMM