血清淀粉樣P物質(zhì)對ApoE---小鼠動脈粥樣硬化的影響.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病是指脂質(zhì)在受累動脈管壁沉積，最先形成脂質(zhì)條紋，發(fā)展為纖維斑塊，最終形成粥樣斑塊的慢性過程，斑塊破裂、血栓形成等可造成相應(yīng)供血部位缺血壞死，造成心肌梗死、腦卒中等嚴(yán)重危害人類健康的疾病。隨著居民生活水平的提高，動脈粥樣硬化性心血管病(Atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)發(fā)病率和死亡率逐年攀升，已成為威脅中國乃至世

2、界人群健康和疾病的重要殺手。作為ASCVD重要的病理生理基礎(chǔ)，積極探索AS的發(fā)病機(jī)制和尋求安全有效的治療方法成為國內(nèi)外學(xué)者面臨的重大課題。
　　血清淀粉樣P物質(zhì)(serum amyloid P component，SAP)是一種在進(jìn)化上高度保守的環(huán)狀五聚體結(jié)構(gòu)蛋白，作為一種可溶性模式識別分子，是固有免疫的重要組成部分。由于SAP主要與淀粉樣沉積物形成結(jié)合物存在，最初在淀粉樣變性疾病中被人們發(fā)現(xiàn)，雖然與CRP同屬于短正五聚蛋白超家族

3、，但在炎癥和固有免疫中的作用卻不相同。近年來人們發(fā)現(xiàn)SAP除了參與阿爾茨海默病的發(fā)生，與心血管疾病如急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛等發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)，此外還影響2型糖尿病的發(fā)生，而糖尿病人群是心血管疾病風(fēng)險的高危因素。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，SAP在冠心病病人血清中濃度明顯高于普通人群;對臨床病人的主動脈標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)部有大量SAP沉積，并且與ApoCⅡ結(jié)合的方式共同出現(xiàn)，這證明SAP在心血管疾病尤其是AS中扮演重要角色，

4、然而關(guān)于SAP對AS的具體作用及相關(guān)機(jī)制仍不是十分明確。
　　目的：
　　本研究通過對小鼠腹腔注射SAP，觀察ApoE-/-小鼠AS斑塊形成情況，比較SAP對ApoE-/-小鼠血脂水平，炎癥因子(IL-6、IL-10和MCP-1)水平以及HDL功能（PON1活性、巨噬細(xì)胞膽固醇流出率）以及動脈粥樣硬化的影響，從而探討SAP影響AS進(jìn)展可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1、動物分組及干預(yù)
　　12只8周大小的C5

5、7BL/6雄性小鼠予普食喂養(yǎng)作為正常對照組;24只8周大小的雄性ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)。實驗第12周時將24只高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠隨機(jī)平均分成PBS組和SAP組，SAP組小鼠予腹腔注射SAP(6mg/g)，隔天一次，共2周;正常組和PBS組小鼠予腹腔注射同體積的PBS，隔天一次，共2周。正常組繼續(xù)予普食喂養(yǎng)，PBS組和SAP組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)至第16周結(jié)束實驗。
　　2、標(biāo)本采集
　　實驗結(jié)束時使小鼠

6、禁食禁水共12小時，乙醚吸入麻醉，留取血液標(biāo)本，離心后分裝凍存?zhèn)溆?。PBS沖洗血管后持續(xù)注入4％多聚甲醛灌注固定，大體顯微鏡下分離主動脈標(biāo)本，一部分主動脈根部置于-20℃凍存，留做冰凍切片行油紅O染色;其余主動脈置于4％多聚甲醛中固定24h，制作石蠟切片行HE染色和免疫組化染色。
　　3、血脂檢測
　　取凍存?zhèn)溆玫母鹘M小鼠血清，采用小鼠血脂檢測試劑盒在多功能酶標(biāo)儀上檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固

7、醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。
　　4、血清PON1活性測定和巨噬細(xì)胞膽固醇流出率檢測
　　以乙酸苯酯作為底物檢測各組小鼠血清PON1活性;用[3H]膽固醇刺激RAW264.7細(xì)胞24小時，同時加入氧化低密度(ox-LDL)促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬，再加入各組小鼠血清促進(jìn)[3H]膽固醇流出，分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解物，采用液閃計數(shù)儀檢測巨噬細(xì)胞[3H]膽固醇流出率。
　　5、炎癥因子IL-6、IL-

8、10、MCP-1和SAP表達(dá)水平檢測
　　使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒檢測三組小鼠血清IL-6、IL-10、MCP-1和SAP表達(dá)水平，實驗方法參照相應(yīng)試劑盒檢測說明書。
　　6、主動脈斑塊形成情況
　　HE染色觀察主動脈橫切面斑塊形態(tài)并測量主動脈斑塊面積大小;油紅O染色觀察大體主動脈斑塊面積及斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集情況。
　　7、斑塊內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞和SAP表達(dá)檢測
　　免疫組化法檢測主動脈斑塊

9、內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞浸潤和SAP表達(dá)情況。
　　8、統(tǒng)計學(xué)處理
　　所有的實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，利用專業(yè)統(tǒng)計軟件SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗;三組間數(shù)據(jù)比較，如果方差齊性采用單向方差分析(one-way ANOVA)，如果方差不齊采用Welch校正檢驗。多重比較時，如果方差齊性使用LSD法檢驗，方差不齊使用Dunnett's T3檢驗，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。<

10、br>　　結(jié)果：
　　1、各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平測定
　　與正常組小鼠相比，PBS和SAP組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，HDL-C水平明顯降低(P＜0.05);與PBS組相比，SAP組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平雖無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但有下降趨勢，HDL-C水平有所上升，但尚未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2、各組小鼠血清PON1活性和

11、巨噬細(xì)胞膽固醇流出率比較
　　與正常組(146.3±28.3ku/L)相比，PBS組(62.1±21.7ku/L，P=0.000)和SAP組(95.8±29.7ku/L，P=0.005)小鼠血清PON1活性明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;SAP組PON1活性明顯高于PBS組(P=0.046)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與正常組（13.7±2.5％）相比，PBS組(7.2±1.8％，P=0.000)和SAP組(9.4±1.7％，

12、P=0.000)小鼠血清膽固醇轉(zhuǎn)出率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;SAP組與PBS組相比(P=0.017)，膽固醇轉(zhuǎn)出率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3、各組小鼠血清炎癥因子IL-6、IL-10、MCP-1和SAP水平比較
　　與正常組(14.4±3.4pg/ml)相比，PBS組(21.3±1.8pg/ml，P=0.000)和SAP組(23.9±1.9pg/ml,P=0.000)小鼠血清IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計

13、學(xué)意義;SAP組與PBS組相比，明顯升高(P=0.025)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與正常組(199.3±58.2pg/ml)相比，PBS組(106.7±20.9pg/ml，P=0.000)小鼠血清IL-10水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;SAP組小鼠血清IL-10水平(153.4±57.0pg/ml，P=0.106)較正常組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;SAP組與PBS組相比，IL-10明顯升高(P=0.012)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

14、。
　　與正常組(125.0±45.5pg/ml)相比，PBS組(689.8±274.8pg/ml，P=0.000)和SAP(465.4±63.4pg/ml，P=0.003)組小鼠血清MCP-1水平明顯升高，達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異;進(jìn)一步比較SAP組和PBS組，前者M(jìn)CP-1水平明顯下降(P=0.032)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　正常組(15.8±8.1ug/ml)小鼠血清SAP水平明顯低于PBS組(83.2±39.5ug/ml)和

15、SAP組(95.6±39.1ug/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001);SAP組與PBS組相比，前者SAP水平有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、各組小鼠主動脈斑塊形成情況
　　與PBS組(23.2±7.2％)相比，SAP組(14.5±5.3％)小鼠主動脈根部HE染色提示斑塊面積明顯降低(P=0.039)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與PBS組(7.2±2.1×105um2)相比，SAP組(5.

16、5±1.4×105um2)小鼠主動脈根部油紅O陽性面積明顯降低(P=0.028)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與PBS組（7.6±2.8％）相比，SAP組（4.1±1.6％）小鼠主動脈大體油紅O染色陽性面積百分比明顯下降(P=0.023)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、小鼠主動脈斑塊內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞浸潤情況和SAP表達(dá)測定
　　與PBS組（28.4±7.1％）相比，SAP組（18.0±3.7％）小鼠主動脈斑塊內(nèi)CD68陽

17、性巨噬細(xì)胞含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。
　　與PBS組（1.62±0.14％）相比，SAP組（2.14±0.45％）小鼠主動脈斑塊內(nèi)SAP陽性面積明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)。
　　結(jié)論：
　　1、SAP可改善HDL功能，包括提高PON1活性水平，增加巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)出率。
　　2、SAP改善HDL功能的同時可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，包括升高抗炎因子IL-10的濃度，抑制促炎因子MCP