酶育牛黃對(duì)apoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　探討酶育牛黃(calculus bovis cultivated by glucuronidase，CBCG)對(duì)載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響，闡明CBCG對(duì)血漿和動(dòng)脈炎癥和氧化應(yīng)激水平的作用。
　　方法
　　40只7-8周齡雄性apoE-/-小鼠，隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（酶育牛黃溶媒灌胃組，n=10）、CBCG低、中、高劑量治療組(0.25 g/kg·d、0.75 g

2、/kg·d、2.25 g/kg·d，n=10)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)灌胃8周，同時(shí)給予高脂(15.8％)高膽固醇(1.25％)飲食，自由飲水。灌胃8周末，禁食12小時(shí)，麻醉，小鼠內(nèi)眥靜脈取血，取材。解剖分離主動(dòng)脈全長，包埋心底制備主動(dòng)根部連續(xù)冰凍切片，油紅O染色主動(dòng)脈全長和主動(dòng)脈根部，檢測(cè)粥樣斑塊脂質(zhì)含量，計(jì)算斑塊面積;Elisa檢測(cè)血漿炎癥因子IL-6和TNF-α水平，分光光度計(jì)法檢測(cè)血漿丙二醛(MDA)和對(duì)氧磷酯酶-1(PON1)

3、水平;Elisa測(cè)定CBCG血漿活性成分膽紅素(Bilirubin)和?；撬?Taurine)水平;免疫熒光化學(xué)方法檢測(cè)主動(dòng)脈瓣部位巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子（MOMA-2）、血管細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）、細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)和α腫瘤壞死因子(TNF-α)，4羥基壬烯醛(HNE)，磷酸化Janus酪氨酸激酶(P-JAK2)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1(P-STAT1)表達(dá)水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最后，酶法測(cè)定血漿總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽

4、固醇(HDL-C)水平;肝、腎臟制作石蠟切片，HE染色，進(jìn)一步了解CBCG長期灌胃給藥的安全性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，ox-LDL(100μg/ml)刺激巨噬細(xì)胞，CBCG(溶解于DMSO)直接干預(yù)細(xì)胞，Elisa方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6和IFN-γ水平;western blot檢測(cè)JAK2/STAT1/SOCS1信號(hào)通路蛋白表達(dá)。
　　相同周齡雄性C57BL/6J小鼠41只，隨機(jī)分3組對(duì)照組(酶

5、育牛黃溶媒灌胃組，n=14)、CBCG高、中劑量治療組(2.25g/kg·d，n=14;0.75g/kg·d，n=13)。同樣給予高脂飼料，連續(xù)灌胃12周后，禁食12h，麻醉，小鼠內(nèi)眥靜脈取血，通過超速離心法獲得低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL3)。通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HDL對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的膽固醇溢出的影響;通過HDL對(duì)Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化程度的保護(hù)作用，檢測(cè)HDL的抗氧化功能;通過MTT比色法

6、檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HDL抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡功能;通過單核細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HDL保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果
　　與對(duì)照組組相比，油紅O染色結(jié)果顯示CGCB治療組顯著抑制主動(dòng)脈根部和全長主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣斑塊形成;血漿Elisa檢測(cè)血漿IL-6，TNF-α水平顯著降低;血漿氧化生物指標(biāo)丙二醛(MDA)顯著降低，對(duì)氧磷酯酶-1(PON1)顯著升高;CBCG血漿有效成分檢測(cè)結(jié)果顯示，CBCG高劑量治療組血漿中膽紅素水平顯著高于

7、對(duì)照組，血漿?；撬岢仕缴呲厔?shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主動(dòng)脈根部免疫熒光結(jié)果表明，CBCG可抑制炎癥指標(biāo)粘附分子VCAM-1、ICAM-1和TNF-α的表達(dá)，減少血管壁巨噬細(xì)胞浸潤;CBCG可抑制炎癥通路JAK2/STAT1通路蛋白磷酸化;CBCG可抑制氧化指標(biāo)HNE表達(dá)，降低脂質(zhì)氧化程度;血漿生化檢測(cè)顯示，CBCG治療組總膽固醇(TC)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水

8、平顯著升高;肝腎HE染色未見明顯異常。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，CBCG可顯著抑制ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6，IFN-γ水平，抑制JAK2和STAT的磷酸化，下調(diào)SOCS1水平。另外，CBCG可顯著改善C57BL/6J小鼠血漿HDL功能，主要表現(xiàn)在促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)[3H]標(biāo)記膽固醇的溢出;抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化作用;抑制單核細(xì)胞粘附作用和內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。
　　結(jié)論
　　1.CBCG抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈

9、粥樣硬化斑塊的形成;
　　2.CBCG抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成可能與改善血漿炎癥和氧化應(yīng)激水平有關(guān);
　　3.CBCG抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成可能與減輕斑塊部位炎癥和氧化應(yīng)激程度有關(guān);
　　4.CBCG對(duì)抗apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥機(jī)理可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT1/SOCS1信號(hào)通路有關(guān);
　　5.CBCG改善C57BL/6J小鼠HDL的功能，包括促進(jìn)膽固醇溢出、抗