細(xì)胞穿透肽(Arg)-,9-與力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、力達(dá)霉素（Lidamycin，LDM，C-1027）是由球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）產(chǎn)生的烯二炔類抗生素，是迄今報(bào)道過(guò)的對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的大分子肽類抗腫瘤抗生素，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、抗血管生成活性及抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長(zhǎng)的作用。LDM的分子由烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)（AE）和輔基蛋白（LDP）構(gòu)成，兩者可進(jìn)行拆分和重建，以往的研究表明發(fā)色團(tuán)是力達(dá)霉素分子的活性部分，輔基蛋白具有穩(wěn)定和保護(hù)發(fā)色團(tuán)的功能。輔基蛋白

2、是否具有抗腫瘤活性，目前還沒有定論。
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，是高度血管化的血管生成依賴性生長(zhǎng)的人類腫瘤。目前的報(bào)道表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管微環(huán)境在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展、侵襲、臨床診斷及治療效果中起關(guān)健性作用。由于血腦屏障的存在，限制了大部分抗血管生成藥物在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方面的應(yīng)用。
　　 細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一類以非受體依賴方式、非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過(guò)

3、細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽，它們的長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸且富含堿性氨基酸，能夠介導(dǎo)與其相連的各種本不能通過(guò)細(xì)胞膜的生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。迄今的研究提示CPPs能在體外或體內(nèi)介導(dǎo)一系列生物活性分子如蛋白質(zhì)、肽類、寡聚核苷酸、質(zhì)粒及脂質(zhì)體等進(jìn)入各種不同組織和細(xì)胞，這些重要發(fā)現(xiàn)為將親水性蛋白、寡肽及寡核苷酸應(yīng)用于藥學(xué)、基因治療、細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域開辟了一條新的道路。
　　 本研究利用本室構(gòu)建表達(dá)的力達(dá)霉素重組輔基蛋白rLDP，研究其對(duì)

4、多種腫瘤細(xì)胞的體外親和活性及其體內(nèi)外抗腫瘤活性，通過(guò)分子重建制備重組力達(dá)霉素（rLDM），研究其與正常力達(dá)霉素的結(jié)構(gòu)和活性異同；利用基因工程方法構(gòu)建表達(dá)輔基蛋白與細(xì)胞穿透肽（Arg）9的融合蛋白（Arg）9-LDP，對(duì)其穿膜能力和抗腫瘤活性進(jìn)行研究，再通過(guò)分子強(qiáng)化技術(shù)組裝發(fā)色團(tuán)AE，得到強(qiáng)化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE，研究其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用以及體內(nèi)抑瘤活性。
　　 1.重組力達(dá)霉素的制備及活性分析
　

5、　 利用本室保存的含有pET30-sldp坳質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）starTM菌株，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標(biāo)簽肽（His-tag）的重組輔基蛋白的表達(dá)。重組輔基蛋白rLDP分子量約為12 kDa，除存在于周質(zhì)腔中外，還分泌到培養(yǎng)液上清中。Ni2+親和層析對(duì)培養(yǎng)液上清的蛋白進(jìn)行純化，得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度在98％以上，每升發(fā)酵液得到23 mg活性蛋白。細(xì)胞免疫熒光和基于流式細(xì)胞術(shù)的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示r

6、LDP蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞，如人肺癌A549細(xì)胞、人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞、人肝癌Be1-7402細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞均有很強(qiáng)的結(jié)合活性，而對(duì)正常肝組織來(lái)源的LO2細(xì)胞則無(wú)親和活性。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明rLDP蛋白可抑制Be1-7402細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明rLDP蛋白可引起B(yǎng)e1-7402細(xì)胞周期的G2/M期阻滯，且存在濃度依賴性。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)表明rLDP蛋白能夠顯著抑制小鼠肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)

7、，且毒副作用較小。rLDP蛋白靜脈注射15 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg3個(gè)劑量組11天的抑瘤率分別為44.6％、57.1％和50.1％，與對(duì)照組相比有顯著差異；rLDP蛋白腹腔注射30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg3個(gè)劑量組11天的抑瘤率分別為52.1％、49.3％和59.5％，與對(duì)照組相比有顯著差異：rLDP蛋白灌胃給藥30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg3個(gè)劑量組11天的抑瘤

8、率分別為34.3％、30.2％和60.3％，與對(duì)照組相比有顯著差異。將AE分子與rLDP蛋白在體外進(jìn)行分子組裝后，經(jīng)HPLC檢測(cè)在350 nm處出現(xiàn)了特定的吸收峰，表明AE分子與rLDP蛋白進(jìn)行了成功組裝，得到了重組力達(dá)霉素rLDM。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示重組力達(dá)霉素rLDM對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞系均表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的殺傷作用，其對(duì)L187細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞和Be1-7402細(xì)胞的IC50值與力達(dá)霉素LDM接近。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表

9、明rLDM和LDM在濃度為1 nM時(shí)引起U87細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞周期的S期阻滯和G2/M期阻滯，在濃度為0.001 nM時(shí)SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，L187細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯。
　　 2.細(xì)胞穿透肽（Arg）9與力達(dá)霉素融合蛋白（Arg）9-LDP的構(gòu)建及活性分析
　　 利用基因重組技術(shù)擴(kuò)增含有細(xì)胞穿透肽（Arg）9和力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因的（arg）9ldp片段，連接到質(zhì)粒pET30a（+）上，構(gòu)建重組質(zhì)

10、粒pET30-（arg）9ldp，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）starTM中，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標(biāo)簽肽（His-tag）的融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白分子量約為15 kDa，主要以包涵體形式存在。Ni2+親和柱純化融合蛋白，得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度在95％以上，每升發(fā)酵液得到15 mg活性蛋白。細(xì)胞熒光檢測(cè)和基于流式細(xì)胞術(shù)的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示帶有穿透肽的融合蛋白可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與重組輔基蛋白和牛血

11、清白蛋白相比有明顯差異，其在37℃的穿透能力優(yōu)于4℃，說(shuō)明穿透過(guò)程與能量有關(guān)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其對(duì)U87細(xì)胞的IC50值為5.25×10-5mol/L。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明20μM的融合蛋白可引起U87細(xì)胞周期的G1期阻滯，濃度為200μM時(shí)引起U87細(xì)胞周期的G2/M期阻滯和S期阻滯。
　　 3.細(xì)胞穿透肽（Arg）9與力達(dá)霉素強(qiáng)化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE的制備及活性分析
　　

12、 將含有細(xì)胞穿透肽和力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白（Arg）9-LDP與力達(dá)霉素活性發(fā)色團(tuán)組裝，經(jīng)HPLC檢測(cè)在350 nm處出現(xiàn)了特定的吸收峰，表明強(qiáng)化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE組裝成功。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明強(qiáng)化融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)殺傷作用，強(qiáng)化融合蛋白和力達(dá)霉素對(duì)U87細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的IC50值相近，強(qiáng)化融合蛋白對(duì)OVCAR3細(xì)胞和Be1-7402細(xì)胞的IC50值分別是力達(dá)霉素的1/20和1/10。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明強(qiáng)

13、化融合蛋白可引起U87細(xì)胞周期的G2/M期阻滯和S期阻滯，Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀結(jié)果表明強(qiáng)化融合蛋白以劑量依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)表明強(qiáng)化融合蛋白（Arg）9-LDP-AE對(duì)肝癌H22小鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且毒副作用較LDM小。強(qiáng)化融合蛋白0.2 mg/kg和0.3 mg/kg劑量組抑瘤率分別為85.3％和89.2％，與LDM0.05 mg/kg組相比有明顯提高。（Arg）9-LDP-AE