力達(dá)霉素輔基蛋白與人體腫瘤組織結(jié)合作用的研究以及融合蛋白Fv-LDP免疫活性的研究.pdf

1、力達(dá)霉素(LDM)屬于烯二炔類抗腫瘤抗生素，具有強(qiáng)烈的殺傷癌細(xì)胞和獨(dú)特的DNA切割活性。LDM由烯二炔發(fā)色團(tuán)(AE)和輔基蛋白(LDP)兩部分組成，兩者可拆分和重建。輔基蛋白的主要功能是，對(duì)不穩(wěn)定的、具有殺傷細(xì)胞活性的發(fā)色團(tuán)起保護(hù)作用。本研究的第一部分利用免疫組織化學(xué)方法，結(jié)合組織芯片技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)LDP蛋白具有與人體腫瘤組織特異性結(jié)合的能力；本研究的第二部分，對(duì)LDP蛋白與腫瘤組織的結(jié)合與某些腫瘤治療靶點(diǎn)的相關(guān)性做了進(jìn)一步的研究；第三

2、部分，對(duì)本室利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的抗Ⅳ型膠原酶單鏈抗體scFv與LDP形成的融合蛋白Fv-LDP的免疫活性進(jìn)行了研究。 一、力達(dá)霉素輔基蛋白與人體腫瘤組織結(jié)合作用的研究建立免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)方法。采用了兩條技術(shù)路線：一是將LDP蛋白直接用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記；二是利用本室已制備的抗LDP的鼠單抗抗體。利用IHC的方法檢測(cè)LDP蛋白與腫瘤組織的結(jié)合。結(jié)果表明，兩種方法都是可行的，所檢測(cè)到的LDP蛋白與腫瘤組織的結(jié)合部位完全一

3、致。在第二種方法中所設(shè)定的空白對(duì)照、陰性對(duì)照以及吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)照均無(wú)著色，證明LDP的免疫染色特異，實(shí)驗(yàn)方法可靠。我們采用了第二種方法進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。 選用高密度多腫瘤組織芯片研究LDP蛋白與不同腫瘤組織的結(jié)合能力，結(jié)果表明，在芯片上所包含的17種常見腫瘤中，LDP與膀胱移行細(xì)胞癌的結(jié)合率最高，達(dá)94.4％；與子宮內(nèi)膜腺癌的結(jié)合率最低，為20％。LDP可以與腫瘤組織結(jié)合，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，此種結(jié)合能力在不同的腫瘤組織間存在顯

4、著性的差異(X2=64.0，P＜0.001)。 進(jìn)一步選用乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌及其相應(yīng)正常組織的組織芯片，研究LDP蛋白與腫瘤組織及相應(yīng)正常組織結(jié)合的差異。結(jié)果表明，在乳腺癌41例病例中，LDP染色陽(yáng)性率為73.2％(30/41)，在正常乳腺組織31個(gè)組織芯中，LDP染色陽(yáng)性率為48.3％(15/31)，LDP與乳腺癌及其相應(yīng)正常組織的結(jié)合有顯著性差異(X2=4.63，P=0.03)；對(duì)肺癌及其相應(yīng)正常組織的芯片結(jié)果分析后可知，

5、在肺癌48例病例中，LDP染色陽(yáng)性率為83.3％(40/48)，在正常肺組織50個(gè)組織芯中，LDP染色陽(yáng)性率為30.096(15/50)，LDP與肺癌及其相應(yīng)正常組織的結(jié)合有顯著性差異(X2=28.3，P＜0.001)；結(jié)腸癌及其相應(yīng)正常組織的組織芯片結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌45例組織芯中，LDP染色陽(yáng)性率為66.7％(36/45)，在正常結(jié)腸42個(gè)組織芯中，LDP染色陽(yáng)性率為23.8％(10/42)，結(jié)腸癌及其相應(yīng)正常組織的結(jié)合有顯著性差異

6、(X2=27，P＜0.001)。LDP蛋白在上述器官中，與腫瘤組織的結(jié)合能力與相應(yīng)正常組織相比，有顯著性差異，LDP蛋白可以與腫瘤組織特異性的結(jié)合。 利用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測(cè)LDP蛋白與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果表明，輔基蛋白LDP可以與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，其熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步證明LDP具有與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的能力。 利用激光共聚焦顯微鏡，觀察與腫瘤細(xì)胞孵育后的LDP蛋白可與腫瘤細(xì)胞結(jié)合并被內(nèi)化，攝入LDP蛋白的腫瘤

7、細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，同時(shí)，也觀察到了LDM可引起腫瘤細(xì)胞的明顯凋亡，細(xì)胞核成多核狀；而LDP蛋白可被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化卻不具有此殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。 二、力達(dá)霉素輔基蛋白與腫瘤治療靶點(diǎn)的相關(guān)性研究選用乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌的相同的組織芯片，分別進(jìn)行LDP、VEGF、HER2和EGFR的免疫組織化學(xué)染色。 對(duì)乳腺癌組織芯片的免疫染色進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LDP與乳腺癌的免疫結(jié)合與VEGF以及HER2的過(guò)表達(dá)相關(guān)。在90例乳腺癌中

8、，可供VEGF/LDP分析的病例為87例(96.7％)，其中，在54例LDP陽(yáng)性的病例中，VEGF陽(yáng)性率為88.9％(48/54)，LDP與乳腺癌的免疫結(jié)合能力與VEGF的過(guò)表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.001，r=0.389)；可供HER2/LDP分析的例數(shù)為82例(91.1％)，在54例LDP陽(yáng)性的病例中，HER2的陽(yáng)性率為84.0％(42/54)，LDP與乳腺癌的免疫結(jié)合能力與HER2的過(guò)表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.01，r=0.287)。

9、 對(duì)肺癌組織芯片的免疫染色進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LDP與肺癌的免疫結(jié)合與VEGF以及EGFR的過(guò)表達(dá)相關(guān)。80個(gè)組織芯中，可供VEGF/LDP分析的病例為71例(89％)，其中，在40例LDP陽(yáng)性的病例中，VEGF陽(yáng)性率為60％(24/40)(P＜0.01，r=0.341)；可供EGFR/LDP分析的病例為73例，在40例LDP陽(yáng)性的病例中，EGFR的陽(yáng)性率也為6096(24/40)(P＜0.05，r=0.296)。 對(duì)結(jié)腸癌

10、組織芯片的免疫染色進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LDP與結(jié)腸癌的免疫結(jié)合與VEGF的過(guò)表達(dá)相關(guān)。80個(gè)組織芯中，可供VEGF/LDP分析的病例為62例(78.5％)，在38例LDP陽(yáng)性的病例中，VEGF的陽(yáng)性率為76.3％(29/38)(P＜0.05，r=0.271)。 利用流式細(xì)胞術(shù)的方法，比較融合蛋白SG-LDP和LDP與肺癌細(xì)胞NCI-H460的結(jié)合能力。結(jié)果表明，含有與EGFR受體特異性結(jié)合短肽的融合蛋白SG-LDP與腫瘤細(xì)胞的結(jié)

11、合能力更強(qiáng)。 三、融合蛋白Fy-LDP免疫活性的研究采用ELISA方法、明膠酶譜分析、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、免疫組化等方法對(duì)融合蛋白Fv-LDP的免疫學(xué)活性進(jìn)行分析。間接ELISA結(jié)果表明，融合蛋白與Ⅳ型膠原酶、HT-1080細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、PG細(xì)胞等均具有免疫反應(yīng)性。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)融合蛋白Fv-LDP濃度達(dá)到2mg/ml時(shí)，92kDa負(fù)染條帶消失；當(dāng)濃度達(dá)到4mg/ml時(shí)，72kDa負(fù)染條帶也消失，表明融合蛋白Fv-LDP