以明膠酶為靶點(diǎn)的小型化抗體與力達(dá)霉素構(gòu)建的基因工程強(qiáng)化融合蛋白及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、抗體-藥物偶聯(lián)物的開(kāi)發(fā)是當(dāng)前抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)重要發(fā)展方向，然其成功的發(fā)展在某種程度上有賴(lài)于抗體部分的靶向運(yùn)輸能力和被輸送藥物的生物學(xué)活性。明膠酶在多種腫瘤中高表達(dá)，且在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成中發(fā)揮著重要的作用，來(lái)源于小鼠的單克隆抗體3G11具有特異性結(jié)合明膠酶的特性。力達(dá)霉素是一個(gè)高效的抗腫瘤大分子抗生素，以單克隆抗體3G11為基礎(chǔ)，結(jié)合力達(dá)霉素的特性，我們構(gòu)建了多種類(lèi)型的基因工程融合蛋白。為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗體片段對(duì)明膠酶高表達(dá)

2、腫瘤細(xì)胞的靶向能力和提高抗腫瘤效果，我們作了以下的研究和探索。
　　 一、抗明膠酶的雙單鏈抗體和力達(dá)霉素的融合蛋白dFv-LDP制備及其體內(nèi)的靶向能力研究
　　 隨著抗體工程的研究進(jìn)展，目前認(rèn)為雙價(jià)的單鏈抗體片段具有最佳的腫瘤靶向能力。為了進(jìn)一步提高前期所構(gòu)建的抗明膠酶單鏈抗體和力達(dá)霉素融合蛋白Fv-LDP-AE的抗腫瘤效果，我們構(gòu)建了含有2個(gè)scFv和力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白，將其命名為dFv-LDP。表達(dá)該重組蛋白

3、的質(zhì)粒pET30a（+）/dFv-LDP經(jīng)過(guò)酶切鑒定和序列測(cè)定后，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白dFv-LDP更易于在Rosetta（DE3）pLysS中表達(dá)，產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，目的蛋白經(jīng)純化、復(fù)性后，每升發(fā)酵液可以獲得50 mg純度達(dá)到95％以上有活性的dFv-LDP融合蛋白?？乖璄LISA結(jié)果表明，融合蛋白dFv-LDP與抗原明膠酶的親和常數(shù)為0.04

4、3μM，比單鏈的Fv-LDP融合蛋白的親和力提高了4倍左右。融合蛋白dFv-LDP亦能與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，對(duì)Be1-7402、PG-BE1、HT-1080、HepG2、MCF-7等腫瘤細(xì)胞均呈陽(yáng)性免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明融合蛋白dFv-LDP在一定程度上能被細(xì)胞內(nèi)吞，相對(duì)單鏈的Fv-LDP來(lái)說(shuō)比率有所增加，但總體不太明顯。體內(nèi)的靶向?qū)嶒?yàn)中，融合蛋白dFv-LDP具有比單鏈的Fv-LDP更優(yōu)越的腫瘤靶向能力，在人肝癌Be1-7402

5、、高轉(zhuǎn)移肺癌PG-BE1和結(jié)腸癌HCT-116裸鼠異位移植瘤中展現(xiàn)了優(yōu)良的靶向能力，能夠很快在腫瘤部位富集。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的雙單鏈抗體融合蛋白dFv-LDP具有良好的腫瘤靶向能力，有望在同等條件下攜帶更多的力達(dá)霉素分子到達(dá)腫瘤部位，從而提高抗腫瘤效果并降低對(duì)非靶器官的損傷。
　　 二、融合蛋白dFv-LDP與發(fā)色團(tuán)AE的組裝條件的優(yōu)化
　　 力達(dá)霉素是一個(gè)大分子抗腫瘤抗生素，可以拆分為一個(gè)輔基蛋白和一個(gè)高活性的發(fā)色團(tuán)。

6、該發(fā)色團(tuán)可以和基因工程表達(dá)的含有力達(dá)霉素輔基蛋白結(jié)構(gòu)域的重組融合蛋白組裝，構(gòu)建具有高度活性的強(qiáng)化融合蛋白。然而這種組裝效率受一些因素的影響，本文利用融合蛋白dFv-LDP和發(fā)色團(tuán)AE組裝作為一個(gè)研究對(duì)象，擬對(duì)這些影響因素進(jìn)行分析和研究。利用高效液相色譜分析不同摩爾濃度的力達(dá)霉素并建立其發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白摩爾濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；在此基礎(chǔ)上利用L9（34）正交設(shè)計(jì)分析組裝時(shí)的溫度、時(shí)間、pH以及發(fā)色團(tuán)和基因工程融合蛋白dFv-LDP的摩爾比率4個(gè)

7、因素對(duì)組裝效率的影響，挑選最優(yōu)組裝效率的組合。結(jié)果建立了力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白摩爾濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所選擇的4個(gè)因素對(duì)組裝效率都有明顯的的影響（P<0.01），其影響程度先后順序是溫度>時(shí)間>pH>發(fā)色團(tuán)和融合蛋白dFv-LDP濃度的比率；最優(yōu)的組裝條件為溫度10℃，時(shí)間12h，pH7.0和發(fā)色團(tuán)與蛋白摩爾比率為5:1。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，融合蛋白dFv-LDP與發(fā)色團(tuán)的組裝效率提高了20％左右。該優(yōu)化組裝條件對(duì)其他基因工程表達(dá)的含有力達(dá)霉素輔

8、基蛋白的融合蛋白與發(fā)色團(tuán)組裝有一定的參考價(jià)值。
　　 三、強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE的體內(nèi)抗腫瘤作用研究
　　 小動(dòng)物活體成像表明融合蛋白dFv-LDP具有很好的腫瘤靶向效果，當(dāng)其與發(fā)色團(tuán)AE組裝后，我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)其體內(nèi)的抗腫瘤效果。MTT法表明強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE具有不亞于力達(dá)霉素的對(duì)多種腫瘤細(xì)胞強(qiáng)烈的殺傷能力，IC50值介于1×10-10～10-12M之間。小鼠肝癌H22抑瘤實(shí)驗(yàn)表明，在等摩爾的情況

9、下，強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE比單價(jià)的Fv-LDP-AE有更高的抗腫瘤能力（89.5％ vs84.2％），兩者都較單獨(dú)的力達(dá)霉素（73.6％）有明顯的提高（P<0.05），說(shuō)明抗體攜帶力達(dá)霉素的靶向治療能夠提高力達(dá)霉素的治療效果；在肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤中，dFv-LDP-AE也展現(xiàn)了更好的抗腫瘤效果，0.4 mg/kg，0.6 mg/kg，0.8 mg/kg三個(gè)劑量的dFv-LDP-AE的抑瘤率分別為64.2％、73.1

10、％和87.3％，均強(qiáng)于力達(dá)霉素的63.4％抑瘤率。而0.48 mg/kg的Fv-LDP-AE的抑瘤率為73.9％，小于等摩爾濃度下的（0.8 mg/kg）dFv-LDP-AE的抑瘤效果（P<0.05；dFv-LDP-AE（0.8 mg/kg）vs Fv-LDP-AE（0.48 mg/kg））。說(shuō)明通過(guò)增加一個(gè)Fv片段，在可耐受劑量下提高了抑瘤效果，降低了對(duì)非靶器官的毒副作用。
　　 抗原從腫瘤脫落是抗體-藥物偶聯(lián)物治療的一個(gè)需要

11、考慮的問(wèn)題，同時(shí)也為了進(jìn)一步提高強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE的抗腫瘤效果，我們嘗試了新的給藥方案，即大劑量融合蛋白dFv-LDP聯(lián)合小劑量強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE。在肺癌PG-BE1裸鼠移植瘤中，融合蛋白dFv-LDP在10 mg/kg的抑瘤率為77％，強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4 mg/kg和0.6 mg/kg時(shí)的抑瘤率分別為91.3％和94.2％，較之dFv-LDP融合蛋白有明顯的提高（P<0.05）；但兩者

12、聯(lián)合后，抑瘤率進(jìn)一步增加，兩組6個(gè)老鼠中都有5個(gè)裸鼠的腫瘤體積較治療前縮小了，縮小的百分率分別為22.0％和49.6％，說(shuō)明這種聯(lián)合給藥的方案是有效的，免疫組化檢測(cè)微血管密度CD31和核增值因子Ki-67也證明了這種增效作用。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明融合蛋白dFv-LDP、強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE以及兩者的聯(lián)合可逐步提高抗腫瘤效果。
　　 纖維肉瘤是一種明膠酶高表達(dá)的腫瘤，我們以熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的纖維肉瘤HT-1080為研究對(duì)象，建立

13、了其實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的模型，F(xiàn)ITC標(biāo)記的融合蛋白具有明顯靶向?qū)嶒?yàn)性肺轉(zhuǎn)移灶的特性。在裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，采用融合蛋白dFv-LDP、強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE以及兩者聯(lián)合給藥的方式比較了三者在HT-1080的實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移中的抑制作用。融合蛋白dFv-LDP（10 mg/kg）展現(xiàn)了不錯(cuò)的抗轉(zhuǎn)移的作用，肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為對(duì)照組的55.8％（P<0.01，與對(duì)照組相比）；強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4和0.6 mg/kg的劑量下的轉(zhuǎn)

14、移灶數(shù)目分別為對(duì)照組的41.4％和25.1％（P<0.05，與dFv-LDP10 mg/kg組相比）；聯(lián)合dFv-LDP后，其肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目進(jìn)一步下降，僅為對(duì)照組的20.3％（P<0.05，與dFV-LDP-AE0.4 mg/kg組相比）和13.1％（P<0.05，與dFv-LDP-AE0.6 mg/kg組相比），說(shuō)明通過(guò)聯(lián)合給藥的方式，進(jìn)一步提高了抗轉(zhuǎn)移的效果。融合蛋白dFv-LDP和強(qiáng)化融合蛋白dFv-LDP-AE的聯(lián)合應(yīng)用在臨床纖

15、維肉瘤的治療中有潛在的應(yīng)用前景。
　　 四、抗明膠酶scFv的重鏈CDR3區(qū)與力達(dá)霉素構(gòu)建的基因工程強(qiáng)化融合蛋白及其抗腫瘤作用研究
　　 大劑量未加強(qiáng)化的融合蛋白與小劑量強(qiáng)化的的融合蛋白聯(lián)合能夠進(jìn)一步提高抗腫瘤的效果，但也可能導(dǎo)致免疫原性的增加。為了降低可能發(fā)生的免疫原性，我們做了以下的探索，構(gòu)建、表達(dá)和純化了僅有scFv重鏈CDR3區(qū)與力達(dá)霉素輔基蛋白的CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3兩種融合蛋白?？乖璄L

16、ISA表明融合蛋白CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3兩者的親和力差別不大，與明膠酶的親和常數(shù)Kd值分別為5.78 x10-6和6.563 x10-6M。免疫熒光分析表明融合蛋白CDR3-LDP與腫瘤細(xì)胞M21、HepG2結(jié)合呈陽(yáng)性。強(qiáng)化后的融合蛋白CDR3-LDP-AE具有強(qiáng)烈的抗腫瘤活性，對(duì)Be1-7402和HepG2的IC50分別為1.05x10-11和6.6x10-14mol/L。小鼠肝癌H22動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，融合蛋白CDR

17、3-LDP（10 mg/kg）的抑瘤率為56％；強(qiáng)化融合蛋白CDR3-LDP-AE在0.25和0.5 mg/kg的劑量抑瘤率分別為78.8％和87.1％（P<0.05，與融合蛋白CDR3-LDP相比）；兩者聯(lián)合后，腫瘤抑制率分別提高到85.2％（P<0.05，與CDR3-LDP-AE0.25 mg/kg相比）和92.7％（P<0.05，與CDR3-LDP-AE0.5 mg/kg相比）。
　　 綜上所述，雙價(jià)的融合蛋白dFv-LD