藻藍(lán)蛋白的分離純化、酶解及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、藻藍(lán)蛋白(C-PC)是存在于藻類(lèi)細(xì)胞中的光合輔助色素蛋白。它不僅可作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，而且能提高機(jī)體的免疫功能，清除體內(nèi)的自由基，促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生，在癌癥、潰瘍等疾病的防治上亦卓有成效。本文研究了藻藍(lán)蛋白的分離純化、酶解和藻藍(lán)蛋白及其酶解物的體外抗腫瘤活性，并對(duì)其抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了初步探討。 鈍頂螺旋藻藻粉經(jīng)反復(fù)凍融和超聲破碎處理，離心后上清液經(jīng)過(guò)鹽析、透析得到藻藍(lán)蛋白粗提液。采用羥基磷灰石(HA)兩步柱層析法

2、對(duì)粗提液分離，得到純度A620/A280>4.0的藻藍(lán)蛋白。 采用四因素、三水平正交試驗(yàn)，以MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo)，優(yōu)化胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)藻藍(lán)蛋白的酶解條件，得到的四個(gè)優(yōu)化酶解條件為：(A):溫度:40℃:pH:8；[胰蛋白酶]/[藻藍(lán)蛋白]:1/10；時(shí)間:60分鐘。(B)溫度：37℃；pH：8；[胰蛋白酶]/[藻藍(lán)蛋白]:1/30；時(shí)間：90分鐘。(C)：溫度：40℃；pH:3；[胃蛋白酶]/[藻藍(lán)蛋白]:1/20；時(shí)間：

3、30分鐘。(D)溫度:33℃:pH:0.5.[胃蛋白酶]/[藻藍(lán)蛋白]:1/10；時(shí)間：30分鐘。 采用MTT法研究藻藍(lán)蛋白及其酶解物對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela和黑色素瘤細(xì)胞B16的體外生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明：藻藍(lán)蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用有明顯的劑量效應(yīng)，當(dāng)藻藍(lán)蛋白的濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)Hela和B16的抑制率分別達(dá)到26.3％和19.1％，但對(duì)正常細(xì)胞人腎上皮細(xì)胞293T沒(méi)有明顯的影響。藻藍(lán)蛋白酶解物的抗腫瘤活性明顯高于相

4、同濃度下的藻藍(lán)蛋白。當(dāng)選用酶解條件(A)時(shí)，藻藍(lán)蛋白酶解物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)到43.2％，對(duì)B16細(xì)胞的抑制率為23.2％。酶解條件為(B)時(shí)，藻藍(lán)蛋白酶解物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為28.3％，對(duì)B16細(xì)胞的抑制率則達(dá)到了46.4％。酶解條件為(C)時(shí)，藻藍(lán)蛋白酶解物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)到45.1％，對(duì)B16細(xì)胞的抑制率為7.8％。酶解條件為(D)時(shí)，藻藍(lán)蛋白酶解物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為39.8％，對(duì)B16細(xì)胞的抑制率則達(dá)到

5、45.6％。由此的出結(jié)論：不同酶解條件下得到的酶解物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用有很大的差異。 用酶解條件為(B)時(shí)得到的藻藍(lán)蛋白酶解物處理B16細(xì)胞，經(jīng)Hochst33258熒光染色和比色法檢測(cè)凋亡蛋白酶Caspase-3活性，研究藻藍(lán)蛋白酶解物的抗腫瘤機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白酶解物處理B16細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，Caspase-3活性達(dá)到最高。得出結(jié)論，藻藍(lán)蛋白及其酶解物可能是通過(guò)激活Caspase-3家族蛋白誘導(dǎo)腫