蛇毒的分離、純化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、蛇類在世界范圍內(nèi)分布廣泛,種類繁多,在中國(guó)大陸已發(fā)現(xiàn)200多種蛇種及54種亞種。因此,對(duì)蛇毒中富含的生物活性成份研究與開(kāi)發(fā)一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)關(guān)注的重要研究領(lǐng)域。近年來(lái),研究者分離純化出一些蛇毒中的酶類及神經(jīng)毒素等活性物質(zhì),其生物活性也得到了應(yīng)用。但蛇毒中的多種蛋白成分及其生物活性功能仍不為人類所了解。與國(guó)際研究水平相比,國(guó)內(nèi)至今只對(duì)其中少數(shù)幾種粗毒或部份純化的蛋白組分進(jìn)行了抗腫瘤作用研究,絕大部分蛇毒抗腫瘤成分都沒(méi)有被發(fā)掘出來(lái)。本

2、論文以我國(guó)華南地區(qū)廣西常見(jiàn)的眼鏡蛇毒為分離樣品源,進(jìn)行了蛇毒蛋白的純化、分離,檢測(cè)其抗腫瘤活性,對(duì)眼鏡蛇毒各組分進(jìn)行跟蹤篩選與評(píng)價(jià),旨在為發(fā)現(xiàn)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤作用活性物質(zhì)打下理論基礎(chǔ)。
　　 首先,選取眼鏡蛇、蝮蛇、金環(huán)蛇和蟒蛇為原料,檢測(cè)四種蛇毒對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,確定這四種蛇毒的抗癌活性作用依次減弱；利用MTT法檢測(cè)眼鏡蛇毒和蝮蛇毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為5.12和22.50μg/mL,而蟒

3、蛇毒和金環(huán)蛇毒的IC50均大于100μg/mL。
　　 選擇抗腫瘤活性作用最為明顯的眼鏡蛇毒做進(jìn)一步研究。利用FOCUSTM_Mammalian Proteome試劑盒結(jié)合真空濃縮離心系統(tǒng)處理,得到蛇毒粗純蛋白樣品。眼鏡蛇毒粗純蛋白對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.07μg/mL。眼鏡蛇毒和蛇毒粗純蛋白對(duì)人肝正常HL-7702細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性,并對(duì)比腫瘤細(xì)胞的IC50值,確定蛇毒粗純蛋白選擇性更強(qiáng)。

4、>　　 為研究蛇毒粗純蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖的時(shí)效和量效關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)繪制蛇毒粗純蛋白處理后HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示其可濃度和時(shí)間依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞增殖。采用吖啶橙染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)呈時(shí)間和濃度依賴性變化,低濃度蛇毒粗純蛋白處理組細(xì)胞圓縮、貼壁能力下降,密布黃綠色芽孢狀突起；各組細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密的黃綠色熒光,甚至可見(jiàn)濃染的黃綠色碎片,呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；在高濃度處理組有一定的壞死細(xì)胞出現(xiàn),細(xì)胞膜破裂,

5、呈彌散狀。
　　 以Tris-HCl緩沖液(20mM,pH8.0)為洗脫體系,用0-0.5 M NaCl的Tris-Hcl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫,洗脫流速為0.5 mL/min,建立眼鏡蛇毒粗純蛋白的離子交換層析分離方法,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,共得到四個(gè)吸收峰,其中一、二兩個(gè)洗脫峰是蛇毒粗純蛋白的主要成分。進(jìn)一步采用高效液相比較分析各洗脫峰下所對(duì)應(yīng)餾分的蛋白洗脫模式。各餾分的液相分析選用反相柱(Lichrospher C18,1

6、50×4.6mm,5μm i.d.),上樣量20μL,流動(dòng)相為A(0.1％v/v TFA,98％v/vACN),流動(dòng)相B(0.1％v/v TFA,2％v/v ACN),按14.7％-88.2％ACN(15-90％流動(dòng)相A)比例進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.8 mL/min,紫外全波長(zhǎng)掃描。第一洗脫峰,餾分9-12,含有多種蛋白成分,其中兩類疏水性、紫外吸收特性各異的蛋白混合物含量較高,而另外三個(gè)吸收峰分別存在單一蛋白,它們的疏水性及光譜特性均

7、有所不同。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用BCA法檢測(cè)各餾分總蛋白含量,結(jié)果與離子交換柱洗脫曲線一致。根據(jù)分析結(jié)果,選取四大沈脫峰中的代表性餾分,進(jìn)一步追蹤篩選其活性,并通過(guò)SDS-PAGE法定性鑒定對(duì)應(yīng)餾分的蛋白分子量大小。結(jié)果顯示相比眼鏡蛇毒粗純蛋白,各餾分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)較大。其中第一沈脫峰抗癌活性最強(qiáng),它對(duì)應(yīng)的是兩類疏水性各異的蛋白混合物,在反相色譜平緩洗脫條件下仍然難以分開(kāi),蛋白分子量分布于<14-3