擬諾卡氏放線菌抗腫瘤活性物分離純化及其活性研究.pdf

1、放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強原核生物，在生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生大量的抗生素、酶及抑制劑等具有生物活性的物質(zhì)，因而是一類具有重要經(jīng)濟價值和生物學功能的微生物資源。從全國各地采集的土樣中篩選出49株放線菌，經(jīng)抗腫瘤活性檢測，從中篩選出一株具有廣譜高效抗腫瘤活性的放線菌。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性比對分析，確定該菌株為擬諾卡氏放線菌，命名為Nocardiopsis.spX032，簡稱NX

2、032（保藏號為CCTCC NO:M2015361），并通過多步分離純化分別得到具有抗腫瘤活性的小分子和蛋白質(zhì)。
　　NX032發(fā)酵培養(yǎng)12天，發(fā)酵上清液通過DM-301大孔樹脂吸附，經(jīng)高效液相色譜(Agilent1290 Infinity)分析，獲得具有抗腫瘤活性的小分子物質(zhì)Peak1;同時發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀，蛋白粗提物利用sephadexG75葡聚糖凝膠柱分離，收集峰A進行活性檢測和SDS-PAGE分析，得到具有抗腫瘤活性

3、的單一蛋白條帶。LC-MS/MS鑒定表明Peak1分子量大小為158.03 KDa，峰A蛋白為ATP synthase subunit a，其大小30.2 KDa。
　　Peak1(NZF1)和活性物質(zhì)峰A(NZP1)分別作用于小鼠黑色素瘤細胞(B16)、人宮頸癌細胞(Hela)、人肝癌細胞(Hep-3B)和人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)。MTT數(shù)據(jù)顯示，三種腫瘤細胞增殖受到明顯抑制，且具有濃度依賴性，對正常細胞HUVEC增殖影

4、響相對腫瘤細胞較小。DNA Ladder實驗中，NZF1和NZP1處理B16細胞，DNA在瓊脂糖凝膠檢測時均出現(xiàn)了“梯狀”條帶。經(jīng)Hochest33342、tubulin Alexa Fluor488和MitoTrackerRed CMVRos分別對細胞進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡（Confocal）觀察亞細胞結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:腫瘤細胞整體皺縮變小變圓，細胞核形狀變得不規(guī)則，染色質(zhì)出現(xiàn)凝聚，微管蛋白熒光分布極不均勻，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，處

5、理組HUVEC細胞與陰性對照相比變化不大。流式細胞儀檢測細胞周期阻滯和凋亡與壞死結(jié)果顯示:NZF1處理后將細胞阻滯在G2期，NZP1處理后將細胞阻滯在S期且二者處理后凋亡區(qū)域細胞數(shù)均明顯上升。Western blot實驗結(jié)果顯示，NZF1和NZP1處理后促凋亡相關(guān)因子PARP, Bax表達上調(diào)，而抑制凋亡相關(guān)因子Bcl-2表達下調(diào)。上述結(jié)果表明，NZF1和NZP1可能是通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡，且對正常細胞影響較小。這為擬諾卡氏放