壇紫菜藻紅蛋白提取、分析及抗腫瘤活性研究.pdf

1、壇紫菜（Porphyraaitanensis）是我國南方沿海人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)海藻主要品種之一，資源豐富。壇紫菜含有豐富的藻紅蛋白（phycoerythrin、PE），可用于大量制備PE的原料。近年來，已有學(xué)者對壇紫菜藻紅蛋白提取、分離純化、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性等作了一些研究，但目前藻紅蛋白的生理活性研究還很不夠，尤其是其抗腫瘤活性未見報(bào)道。本論文對產(chǎn)于廣東汕頭南澳海區(qū)壇紫菜中的藻紅蛋白進(jìn)行了以下研究：
　?。?）藻紅蛋白提取分離采用反復(fù)

2、凍融法破碎藻體細(xì)胞，25％～50%飽和度硫酸銨二步鹽析沉淀藻紅蛋白得粗提物，利用兩步柱層析對藻紅蛋白粗提物進(jìn)行分離純化，即先過sephadexG-100層析柱再過DEAE-cellulose柱層析。在此條件下分離得到的藻紅蛋白純度（A565/A280）達(dá)3.3，藻紅蛋白得率為1.68mg/g干壇紫菜。
　?。?）藻紅蛋白組成結(jié)構(gòu)分析SDS-PAGE電泳分析顯示：壇紫菜藻紅蛋白有α、β、γ三個(gè)亞基，分子量分別為18KDa、23KDa

3、和33KDa；紫外光譜及熒光發(fā)射光譜分析可見藻紅蛋白在490nm、532及570nm處有吸收峰，最大吸收峰為565nm，據(jù)此判斷該藻紅蛋白為R型藻紅蛋白（R-PE），與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致。
　　（3）體外抗腫瘤作用及機(jī)理利用MTT比色法探討了R-PE光動力治療（Phtodyna-mictherapy，PDT）對人宮頸癌Hela細(xì)胞的影響。結(jié)果表明：R-PE結(jié)合PDT（簡稱R-PE+PDT）處理能夠顯著增強(qiáng)R-PE對Hela細(xì)胞的殺

4、傷作用，60μg/mL的R-PE+PDT處理24h對Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)81.4%,在此處理?xiàng)l件下人正常內(nèi)皮細(xì)胞生長幾乎不受影響。利用AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色法檢測了經(jīng)R-PE+PDT處理的Hela細(xì)胞，結(jié)果表明，在劑量為0～60μg/mL范圍內(nèi)，隨著R-PE劑量的增加，凋亡細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞隨之增多，提示R-PE可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，而PDT處理可以加強(qiáng)這一作用。DNAladder電泳結(jié)果顯示：經(jīng)R-

5、PE+PDT處理Hela細(xì)胞，Hela細(xì)胞基因組DNA在100～400bp出現(xiàn)壞死解散的彌散條帶。QRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，R-PE能夠顯著提高Hela細(xì)胞中caspase-3、caspase-10基因表達(dá)水平、下調(diào)抗凋亡蛋白基因Bcl-2表達(dá)水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制Hela細(xì)胞的生長。
　?。?）體外抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測了R-PE對DPPH·自由基的清除作用，當(dāng)2.5mg/mLR-PE（純度2.45）時(shí)對DPPH·清除率

6、達(dá)89.4%，明顯高于對照物維生素C。
　　（5）利用小鼠S180腫瘤模型，研究了R-PE體內(nèi)抗腫瘤作用及其機(jī)理。R-PE溶液經(jīng)口灌胃，當(dāng)給藥劑量為300mg/kg·d時(shí)，抑瘤率達(dá)到41.3%。對荷瘤小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測定結(jié)果表明，R-PE能提高機(jī)體抗氧化能力；免疫作用研究發(fā)現(xiàn)，R-PE對荷瘤小鼠胸腺、脾臟等免疫器官有很好的保護(hù)作用，能提高荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞對ConA的增殖反應(yīng)，增強(qiáng)荷瘤