壇紫菜轉(zhuǎn)基因及別藻藍(lán)蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、本文從電轉(zhuǎn)化條件、外源基因?qū)敕椒?、同源重組序列和MAR序列、啟動(dòng)子、載體構(gòu)型等方面，系統(tǒng)研究了外源基因?qū)雺喜嗽|(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上，將由質(zhì)體編碼的別藻藍(lán)蛋白基因?qū)氲饺旧wDNA中。同時(shí)構(gòu)建了別藻藍(lán)蛋白共表達(dá)載體，建立了原核表達(dá)、純化的工藝技術(shù)，并對(duì)其體外清除自由基和胃癌細(xì)胞SGC-7901生長的作用進(jìn)行了初步的分析，主要研究結(jié)果如下： 1.以野生壇紫菜為材料，利用自制的海螺酶酶解獲得原生質(zhì)體，以CAT作為報(bào)告

2、基因，探討了不同方法將外源基因?qū)雺喜嗽|(zhì)體的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行外源基因?qū)霑r(shí)，可選擇電壓強(qiáng)度為1kV/cm，電轉(zhuǎn)化緩沖液中含0.8mol/L甘露醇，以及原生質(zhì)體密度在1.2×106～1.6×106cells/mL之間，此時(shí)電轉(zhuǎn)化效果最好；電轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化+聚乙二醇(PEG)法、電轉(zhuǎn)化+脂質(zhì)體法、PEG法和脂質(zhì)體法等均可將外源基因?qū)雺喜嗽|(zhì)體并獲瞬時(shí)表達(dá)，其中以電轉(zhuǎn)化+PEG法導(dǎo)入效率最高。 2.構(gòu)建

3、了以SV40或CaMV35S為啟動(dòng)子、含有壇紫菜18SrDNA同源片段、家蠶MAR序列以及CAT基因的同源重組表達(dá)質(zhì)粒pSV40-MAR-HR-CAT和p35S-MAR-HR-CAT，利用電轉(zhuǎn)化+PEG法將質(zhì)粒分別導(dǎo)入壇紫菜原生質(zhì)體。CAT-ELISA檢測(cè)的結(jié)果表明，同源重組序列和MAR序列明顯可以提高CAT表達(dá)量；導(dǎo)入線性質(zhì)粒也可提高外源基因在壇紫菜原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)；在壇紫菜原生質(zhì)體中，兩種啟動(dòng)子均可驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)，但SV40

4、啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)要比CaMV35S啟動(dòng)子更為有效。 3.通過構(gòu)建含有壇紫菜別藻藍(lán)蛋白基因(apcAB)和18srDNA同源重組序列及家蠶MAR序列的同源重組表達(dá)質(zhì)粒pSAB，并利用電轉(zhuǎn)化+PEG法將其導(dǎo)入壇紫菜原生質(zhì)體。對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行氯霉素篩選，并分別從DNA水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析和檢測(cè)。氯霉素篩選的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化組的壇紫菜原生質(zhì)體對(duì)氯霉素的抗性明顯比對(duì)照組的要高，提示CAT基因可以作為壇紫菜遺傳轉(zhuǎn)化研究

5、很好的篩選標(biāo)記基因。PCR、PCR-Souther及基因組的Southernblotting的檢測(cè)結(jié)果顯示，利用同源重組序列可以將由質(zhì)體編碼的apcAB基因整合到壇紫菜基因組中。Northern斑點(diǎn)雜交和ELISA及Westernblotting檢測(cè)的結(jié)果表明，家蠶MAR和壇紫菜18srDNA序列可以明顯提高外源基因在壇紫菜細(xì)胞中的表達(dá)。 4.構(gòu)建了能夠同時(shí)高效表達(dá)壇紫菜別藻藍(lán)蛋白(APC)a和APCβ亞基的共表達(dá)載體pTO-T

6、7-apcAB，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblotting和質(zhì)譜鑒定，并通過柱層析等方法對(duì)表達(dá)的重組別藻藍(lán)蛋白(rAPC)進(jìn)行了分離純化。結(jié)果顯示：構(gòu)建的共表達(dá)載體能同時(shí)表達(dá)rAPCα和APCβ亞基，而且分子量大小與預(yù)期一致，分別為19.7KD和17.0KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)6h時(shí)，rAPC表達(dá)量達(dá)到最大，達(dá)菌體總蛋白50％以上。Wester

7、nblotting和質(zhì)譜鑒定的結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白確為APC，而且rAPC仍具免疫活性。rAPC包涵體經(jīng)SKL溶解、透析后再經(jīng)SephadexG-50凝膠層析和DEAE-SephadexA-50離子交換層析可得到較純的目的蛋白。 5.純化了壇紫菜APC和rAPC，通過DPPH·法和MTT法分別檢測(cè)了不同濃度的上述蛋白體外清除自由基的活性和對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壇紫菜APC和rAPC在體外均有清除