2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、力達霉素(lidamycin,LDM),原名C-1027,是一種新型的烯二炔類抗腫瘤抗生素,由球孢鏈霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)產(chǎn)生。其抗腫瘤活性比臨床常用的阿霉素強10,000倍,已經(jīng)進入臨床II期試驗。力達霉素由一個酸性輔基蛋白CagA(C-1027apoprotein、C-1027AG,也寫作LDP)和一個烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(chromophore,也寫作LDC)非共價結(jié)合組成,發(fā)

2、色團為活性組分,輔基蛋白保護和運載發(fā)色團。由于力達霉素自身具有輔基蛋白,可以將其與抗腫瘤抗體偶聯(lián)成為融合蛋白,改造為靶向特異腫瘤的載體,構(gòu)建導(dǎo)向性力達霉素。IV型膠原酶降解細胞基底膜中的Ⅳ型膠原,破壞基底膜及細胞外基質(zhì)的完整性,引起腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移,IV型膠原酶已經(jīng)成為抗腫瘤研究的靶標(biāo)??笽V型膠原酶抗體可以抑制IV型膠原酶的活性并可作為導(dǎo)向藥物的載體。
   本工作根據(jù)已知的抗IV型膠原酶單鏈抗體基因序列,設(shè)計合成了具有鏈

3、霉菌偏好密碼子的抗IV型膠原酶單域抗體VH(抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區(qū))基因,構(gòu)建了含有輔基蛋白與抗IV型膠原酶單域抗體融合蛋白基因cagA-VH和用于篩選的阿普霉素抗性基因aac(3)IV的重組質(zhì)粒pBSH,用接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入力達霉素產(chǎn)生菌S.globisporusC-1027,通過同源重組雙交換,以cagA-VH-aac(3)IV取代力達霉素生物合成基因簇中原有的輔基蛋白基因cagA,得到基因工程菌株S.globisporusC

4、-1027VH,以獲得Ⅳ型膠原酶靶向的力達霉素。對基因工程菌株進行發(fā)酵,以枯草桿菌(Bacillussubtilis)為檢定菌,結(jié)果表明基因工程菌株發(fā)酵液具有一定的抑菌活性,但與原產(chǎn)生菌相比活性較低。經(jīng)Westernblot分析在胞內(nèi)能檢測到融合蛋白和降解的輔基蛋白,而胞外僅檢測到降解的輔基蛋白條帶。ELISA檢測到融合蛋白的免疫活性。同時構(gòu)建了含有融合蛋白基因cagA-VH但不含抗性基因的重組質(zhì)粒pBS03H,通過同源重組雙交換,以c

5、agA-VH基因取代cagA基因,得到僅融合了抗IV型膠原酶單域抗體基因的基因工程菌株S.globisporusC-1027NVH。同樣進行了發(fā)酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Westernblot的檢測,結(jié)果與S.globisporusC-1027VH基本相同。
   為了增加融合蛋白的表達量,獲得高活性的導(dǎo)向性力達霉素,本工作進一步構(gòu)建了輔基蛋白阻斷株,并通過導(dǎo)入多拷貝的融合蛋白表達質(zhì)粒的策略來提高融合蛋白的表達量。構(gòu)建重組

6、質(zhì)粒pBSA,將質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移至S.globisporusC-1027中,采用同源重組雙交換的方法將cagA基因阻斷。通過抗性篩選、PCR和Southernblot驗證,最終獲得輔基蛋白阻斷株,命名為S.globisporusAKO。用四種輔基蛋白表達質(zhì)粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分別導(dǎo)入在自身啟動子和/或強啟動子控制下的cagA基因?qū)ψ钄嗤蛔冎闟.globisporusAKO進行互補,得到相應(yīng)的

7、互補菌株。對阻斷株和互補菌株進行發(fā)酵,發(fā)酵液的抑菌活性和HPLC分析結(jié)果表明阻斷株完全喪失了力達霉素的產(chǎn)生能力,而互補菌株能不同程度地恢復(fù)產(chǎn)生力達霉素,其中S.globisporusAKO/pKCTA900基本恢復(fù)到野生株的水平。將質(zhì)粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合轉(zhuǎn)移至野生株S.globisporusC-1027中構(gòu)建了相應(yīng)的輔基蛋白過表達菌株。抑菌活性和HPLC分析結(jié)果表明過量表達cagA基因可以提

8、高力達霉素的產(chǎn)量。
   構(gòu)建輔基蛋白.單域抗體的融合蛋白表達質(zhì)粒pKCTH2600、pSETTH2600分別導(dǎo)入輔基蛋白阻斷株中進行表達。重組菌株S.globisporusAKO/pKCTH2600發(fā)酵液的抑菌活性在發(fā)酵晚期與野生株相當(dāng),經(jīng)Western1blot分析在胞內(nèi)、胞外均能檢測到融合蛋白的特異條帶。ELISA檢測到融合蛋白的免疫活性。結(jié)果表明融合蛋白在輔基蛋白阻斷株中以多拷貝質(zhì)粒的形式獲得表達且表達量較基因工程菌株S

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