力達(dá)霉素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制及其信號(hào)傳導(dǎo)通路研究.pdf

1、力達(dá)霉素(1idamycin，LDM)，原名C-1027，烯二炔類(lèi)(enediyne)抗生素家族成員之一，分離自我國(guó)的一株鏈霉菌(StreptomycesglobisporusC-1027)。其分子由一個(gè)酸性的輔基蛋白和一個(gè)發(fā)色團(tuán)結(jié)合而成，發(fā)色團(tuán)是LDM的主要活性部分，起著直接斷裂DNA的作用，而輔基蛋白的主要作用是保護(hù)發(fā)色團(tuán)。以往研究表明，LDM具有高度的抗腫瘤活性，目前正進(jìn)行臨床I期試驗(yàn)。作為DNA損傷劑，LDM可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

2、、凋亡和裂亡。但是LDM誘導(dǎo)周期阻滯的作用機(jī)制及其信號(hào)傳導(dǎo)通路到目前為止還未進(jìn)行過(guò)詳細(xì)研究。本研究的目的是闡明LDM誘導(dǎo)周期阻滯的分子機(jī)制及信號(hào)調(diào)節(jié)通路，從而為L(zhǎng)DM的臨床應(yīng)用提供更深入的理論依據(jù)和治療方案。 一、LDM誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞周期阻滯的作用1.MTT法檢測(cè)LDM對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用與藥物作用時(shí)間的關(guān)系。LDM分別作用2h、4h和24h后，撤去藥液繼續(xù)培養(yǎng)到48h，或LDM一直作用48h，結(jié)果顯示不同的給藥時(shí)間

3、對(duì)IC50值無(wú)明顯影響，分別為0.46±0.14nM、0.32±0.12nM、0.24±0.08nM和0.48±0.11nM，說(shuō)明在48h之內(nèi)LDM抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的能力與藥物暴露時(shí)間無(wú)關(guān)。 2.生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LDM作用24h，再撤去藥液繼續(xù)培養(yǎng)3天，MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞的生長(zhǎng)被明顯抑制，當(dāng)濃度為0.1nM時(shí)，對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為89.93±4.5％和89.77±3.9％(p＞0.05)，說(shuō)明多

4、藥耐藥細(xì)胞對(duì)LDM同樣敏感。 3.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示LDM對(duì)MCF-7細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)作用與濃度有關(guān)。在0.01nM時(shí)，LDM誘導(dǎo)G1期阻滯；但在較高濃度時(shí)(0.1～1nM)，LDM可同時(shí)誘導(dǎo)G1和G2/M期阻滯。而在MCF-7/DOX細(xì)胞中，LDM僅誘導(dǎo)G2/M期阻滯。 由于傳統(tǒng)的PI染色，不能區(qū)分G2和M期，因此我們采用MPM-2/PI雙參數(shù)染色法進(jìn)一步分析LDM對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明LDM將MCF-7細(xì)

5、胞阻滯在G2而不是M期。 4.1nMLDM可增加MCF-7細(xì)胞p53和p21的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性，而且磷酸化(Ser15)p53的表達(dá)也增加，這可能與LDM誘導(dǎo)的G1期阻滯有關(guān)。 5.Westernblot結(jié)果顯示LDM誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的周期阻滯作用與改變細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)有關(guān)，它可以降低cyclinA、cyclinB1、cdc2、磷酸化cdc2、Chk1和磷酸化Chk1的表達(dá)，但是磷酸化Chk2的表達(dá)增加。此結(jié)

6、果說(shuō)明LDM的周期阻滯作用與激活Chk2有關(guān)。 1nMLDM也可以降低MCF-7/DOX細(xì)胞的cyclinA、cyclinB1和磷酸化cdc2的表達(dá)，而cdc2蛋白的表達(dá)在12和24h稍有增加，到48h時(shí)與0h無(wú)明顯變化。 6.Westernblot結(jié)果顯示LDM可降低MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞cyclinB1的表達(dá)，因此我們對(duì)cyclinB1表達(dá)降低的機(jī)制進(jìn)行了更深一步的研究。半定量RT-PCR結(jié)果表明LDM作

7、用24h，MCF-7細(xì)胞的cyclinB1mRNA的水平與對(duì)照比較明顯降低，說(shuō)明LDM抑制了cyclinB1的轉(zhuǎn)錄，而在MCF-7/DOX細(xì)胞中，cyclinB1mRNA的水平無(wú)明顯變化。我們又同時(shí)給予蛋白酶抑制劑LLnL(100μM)和LDM，發(fā)現(xiàn)LLnL在兩種細(xì)胞中都可以逆轉(zhuǎn)LDM引起的cyclinB1蛋白的降低，這說(shuō)明在MCF-7細(xì)胞中LDM也可在蛋白水平促進(jìn)cyclinB1的水解，而在MCF-7/DOX細(xì)胞中的cyclinB1降

8、低只與促進(jìn)蛋白水解有關(guān)。 7.有研究報(bào)道cyclinB1的胞質(zhì)內(nèi)定位與G2期阻滯有關(guān)，因此我們通過(guò)間接免疫熒光染色法檢測(cè)了LDM是否對(duì)cyclinB1的細(xì)胞內(nèi)分布有影響。結(jié)果顯示1nMLDM作用48h，MCF-7細(xì)胞中的cyclinB1只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而在對(duì)照細(xì)胞中，cyclinB1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布，說(shuō)明LDM將cyclinB1定位在細(xì)胞質(zhì)，這是LDM誘導(dǎo)G2期阻滯的原因之一。 二、LDM誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞G

9、2期阻滯1.LDM分別作用2h、4h、24h后再無(wú)藥繼續(xù)培養(yǎng)到48h，或LDM一直作用48h，MTT法檢測(cè)不同的給藥時(shí)間對(duì)IC50值的影響，結(jié)果顯示不同的藥物作用時(shí)間IC50值分別為0.20±0.01nM、0.23±0.08nM、0.19±0.07nM和0.27±0.06nM，無(wú)明顯差異，說(shuō)明在48h之內(nèi)LDM抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的能力與作用時(shí)間無(wú)關(guān)。 2.生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LDM作用24h，再撤去藥液繼續(xù)培養(yǎng)3天，HT-2

10、9細(xì)胞的生長(zhǎng)被明顯抑制，在0.1nM時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為93.42±2.04％。 3.H&E染色法觀察LDM對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，結(jié)果表明0.1nMLDM作用HT-29細(xì)胞48h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，典型表現(xiàn)為細(xì)胞變大、變平，質(zhì)核比例增加。 4.細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，低濃度LDM(0.01-0.1nM)可將HT-29細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，且呈劑量和時(shí)間依賴性。當(dāng)濃度增加到1nM時(shí)，作用48h后，凋亡細(xì)胞的比例增加到3

11、3.5％(sub-G1)，而G2/M期比例降低。 MPM-2/PI雙參數(shù)染色結(jié)果顯示0.1nMLDM作用到24h時(shí)，MPM-2表達(dá)降低，說(shuō)明在此時(shí)細(xì)胞被阻滯在G2期，當(dāng)作用48h時(shí)，MPM-2表達(dá)反而略有升高(從1.52％增加到5.78％)，但與整個(gè)G2/M期比例相比(85.3％)，5.78％只占一小部分，說(shuō)明此時(shí)大部分細(xì)胞仍處于G2期，但是MPM-2陽(yáng)性表達(dá)的那部分細(xì)胞已經(jīng)從G2期進(jìn)入到M期。 5.0.1nMLDM作用

12、48h，cyclinA、cyclinB1、cdc2和磷酸化cdc2的蛋白表達(dá)水平均增加，且呈時(shí)間依賴關(guān)系。雖然Chk1和Chk2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變，但磷酸化(活化形式)Chk1和Chk2的表達(dá)卻增加，說(shuō)明LDM激活了Chk1和Chk2。 另外，不同濃度的LDM作用48h后，cyclinA、cyclinB1、cdc2和磷酸化cdc2的表達(dá)水平在0.01和0.1nM時(shí)增加，但到1nM時(shí)，這些蛋白的水平較0.1nM時(shí)都降低，這可能

13、是由于凋亡細(xì)胞比例增加所致。我們還發(fā)現(xiàn)在p53突變的HT-29細(xì)胞中，LDM不能誘導(dǎo)p21的表達(dá)，說(shuō)明HT-29缺乏G1期關(guān)卡，這可能是LDM在HT-29細(xì)胞中不能誘導(dǎo)G1期阻滯的原因。 6.0.1nMLDM作用HT-29細(xì)胞48h后，cyclinB1也被定位在細(xì)胞質(zhì)中，與MCF-7細(xì)胞中的結(jié)果一致。 三、LDM誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞G2/M期阻滯1.流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示不同濃度的LDM(0.01-1nM)作用48h，HC

14、T116細(xì)胞被阻滯在G2/M期，但是在1nM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例明顯增加。HCT116與MCF-7都是p53野生型的細(xì)胞，但在HCT116細(xì)胞中卻沒(méi)出現(xiàn)明顯的G1期阻滯，有關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 2.在HCT116細(xì)胞中，LDM誘導(dǎo)的G2/M期阻滯與增加p53和磷酸化cdc2的表達(dá)、降低cyclinB1表達(dá)有關(guān)。但是p21的增加不明顯，這可能與LDM在HCT116細(xì)胞中不能明顯誘導(dǎo)G1期阻滯有關(guān)。 四、LDM周期阻滯作用與M

15、APK通路的關(guān)系71.研究證實(shí)MAPK通路與細(xì)胞周期關(guān)卡調(diào)節(jié)有關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)也對(duì)LDM引起周期阻滯的作用與該通路的關(guān)系進(jìn)行了研究。不同濃度LDM(0.01-1nM)作用HT-29細(xì)胞48h，Westernblot結(jié)果顯示磷酸化的(活化形式)ERK1/2和p38的表達(dá)隨劑量增加逐漸增強(qiáng)，但各濃度LDM對(duì)磷酸化JNK的表達(dá)無(wú)明顯改變；同樣在HCT116細(xì)胞中我們也發(fā)現(xiàn)LDM增加磷酸化ERK1/2和p38的表達(dá)，但對(duì)磷酸化JNK的表達(dá)無(wú)改變，

16、說(shuō)明在這兩種細(xì)胞中LDM誘導(dǎo)的周期阻滯作用可能與激活ERK1/2和p38有關(guān)。但是LDM對(duì)MCF-7細(xì)胞p38的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。 2.為了進(jìn)一步分析LDM周期阻滯作用與MAPKs的關(guān)系，我們通過(guò)同時(shí)給予ERK抑制劑(U0126)或p38抑制劑(SB203580)，觀察對(duì)LDM引起的周期阻滯作用是否有影響。Westernblot結(jié)果顯示LDM與U0126或SB203580合用后，磷酸化ERK或磷酸化ATF-2的表達(dá)降低，說(shuō)明抑制

17、了ERK或p38的活化。流式結(jié)果表明在HT-29細(xì)胞中，同時(shí)給予SB203580(20μM)可以部分減少LDM誘導(dǎo)的G2期阻滯(G2期細(xì)胞比例從79.6％降到37.5％)，而且凋亡細(xì)胞比例增加(從3.93％增加到13.0％)，但U0126(10μM)對(duì)LDM誘導(dǎo)的G2期阻滯沒(méi)有明顯改變。相反，在HCT116細(xì)胞中，U0126可以使LDM誘導(dǎo)的G2期阻滯從83.1％降到73.5％，然而SB203580對(duì)LDM引起的周期阻滯卻沒(méi)有明顯改變。

18、在MCF-7細(xì)胞中，SB203580也未影響LDM誘導(dǎo)的G2期細(xì)胞分布。 3.MTT法檢測(cè)20μMSB203580和不同濃度的LDM合用48h后，對(duì)LDM的作用是否有影響。結(jié)果顯示合用SB203580后，HT-29細(xì)胞對(duì)LDM的敏感性增加，這可能是由于激活了凋亡途徑。 4.NRas低表達(dá)的HepG2細(xì)胞對(duì)LDM的敏感性增加，這是否與影響MAPK途徑有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。另外，我們通過(guò)SA-β-gal染色法還發(fā)現(xiàn)LDM誘導(dǎo)