體外誘導替加環(huán)素耐藥糞腸球菌全基因測序及突變位點分析.pdf

1、[目的]
　　1.通過替加環(huán)素(Tigecycline TIG)體外誘導糞腸球菌耐藥，篩選耐藥菌株并進行藥敏鑒定，獲得不同耐藥梯度的菌株群。對部分誘導株進行16SrRNA基因PCR擴增鑒定菌株及序列分析，初步獲得變異位點。
　　2.獲得體外誘導糞腸球菌TIG耐藥株全基因序列并上傳至數(shù)據(jù)庫，獲得Genbank編號，為后續(xù)研究TIG耐藥糞腸球菌基因組進化特點進行序列參考。
　　3.采用SNP calling比較TIG誘導株

2、與敏感原始株全基因序列，獲得SNP數(shù)據(jù)集，初步篩選體外誘導耐藥過程中突變位點并進行基因功能注釋。
　　[方法]
　　1.耐藥菌株的誘導和鑒定:以課題組保存糞腸球菌（編號為DengNZ_CP004081）為原始株， ATCC29212(編號為F4)為質控糞腸球菌。將原始株作為母株進行體外誘導，依次接種在TIG濃度成倍增加的腦心浸出液中，挑選和鑒定陽性克隆。采用PhoenixTM100自動細菌鑒定/藥敏分析儀進行細菌鑒定和普通藥

3、敏試驗，根據(jù)EUCAST標準，采用Etest方法測定誘導菌株TIG的MIC值。
　　2.體外誘導菌株16 SrRNAPCR擴增及序列分析:提取部分糞腸球菌誘導耐藥菌株DNA，常規(guī)PCR擴增細菌16SrRNA基因并進行測序，與原始株序列比對，鑒定菌株并初步獲得變異位點。
　　3.體外誘導株全基因組重測序:以原始株Deng完成圖為參考序列，采用Illumina Hiseq2000對誘導株重測序，拼接全基因序列draft map上

4、傳至Genbank并獲得編號。
　　4.TIG誘導株基因變異位點分析:以原始株Deng參考序列與誘導株序列進行比對，采用Illumina Hiseq2000進行SNP Calling，獲得單核苷酸多態(tài)性(Singlemucleotide polymorphism SNP)，發(fā)現(xiàn)與藥物誘導相關的突變位點及基因，初步分析突變基因功能。
　　[結果]
　　1.對原始株Deng及質控菌株F4進行TIG體外誘導實驗，母株均為敏感

5、株，獲得不同MIC值梯度的菌株群，其中Deng誘導獲得耐藥菌株12株;F4獲得10株。誘導株TIG的MIC值波動在2ug/ml及64ug/ml之間。對Deng-T4-3、Deng-T10-3和Deng-T60-1進行藥敏測試提示，Deng-T10-3和Deng-T60-1對紅霉素由中介變?yōu)槊舾?，對萬古霉素的MIC下降至1ug/ml。
　　2.Deng-T10-3、Deng-T60-1進行16SrRNA基因鑒定與原始株同源性99.9

6、％。分析證實為糞腸球菌，兩誘導株與原始株Deng比較發(fā)現(xiàn)在16SrRNA C469T發(fā)生位點變異。
　　3.對Deng-T10-3、Deng-T60-1進行全基因重測序，上述菌株各產(chǎn)生438×和545×覆蓋度的基因組序列，分別包含1586407135及1279032609堿基數(shù)，GC含量二者相似，均為37.43％、37.42％。兩菌株基因組總大小分別為2920382 bp、2920382 bp。二者經(jīng)基因預測分別包含了2761及2

7、746個基因，GC含量占基因組百分比均為38.1％。將序列上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫獲得Genbank編號，分別為JXMK00000000、JXML00000000。
　　4.Deng-T10-3和Deng-T60-1菌株進行SNP calling，Deng-T10-3在外顯子中獲得20個SNP及1個Small indel，其中非同義突變5個;Deng-T60-1獲得21個SNP及1個Small indel，其中非同義突變?yōu)?個。

8、隨著TIG的MIC值增加，Deng-T60-1比Deng-T10-3新增1個突變基因Deng_2227，該基因主要編碼為糖基轉移酶。
　　[結論]
　　1.TIG在體外可成功誘導不同耐藥水平的糞腸球菌菌株。
　　2.在TIG體外誘導糞腸球菌耐藥株中發(fā)生16SrRNA C469T位點突變，可能與TIG誘導耐藥有關。
　　3.對體外誘導株采用高通量測序方法成功獲得TIG耐藥菌draft map。
　　4.經(jīng)SN