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1、目的:
近10年來(lái),由腸球菌引起的醫(yī)院感染越來(lái)越受到重視,美國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)已將其列為醫(yī)院感染的第二大病原菌,占所有醫(yī)院感染原因的12%。而我國(guó)腸球菌感染亦有明顯增加的趨勢(shì)。在引起醫(yī)院感染的腸球菌中約18%~50%對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥,這些耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococci,VRE)對(duì)多種抗菌藥物均耐藥,如對(duì)青霉素的耐藥率高達(dá)97%,對(duì)高濃度慶大霉素耐藥率達(dá)52.1%,對(duì)高濃度鏈
2、霉素耐藥率達(dá)58.3%,給臨床治療帶來(lái)巨大困難。
利奈唑胺是新型噁唑烷酮類抗生素,被認(rèn)為是目前治療VRE感染和控制VRE醫(yī)院感染暴發(fā)流行的唯一藥物。然而,隨著該藥的大規(guī)模上市使用,在臨床工作中不斷有耐利奈唑胺菌株的報(bào)導(dǎo)。因此,對(duì)耐利奈唑胺腸球菌的研究對(duì)臨床用藥有較大意義。本實(shí)驗(yàn)從利奈唑胺對(duì)腸球菌耐藥的誘導(dǎo)作用入手,先讓腸球菌在體外長(zhǎng)期接觸小劑量利奈唑胺,然后逐步增加利奈唑胺的濃度,觀察腸球菌的生長(zhǎng)情況,判斷腸球菌對(duì)利奈唑胺
3、產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的難易。并通過(guò)比較敏感腸球菌及耐藥腸球菌23s rRNA的基因變化,探討腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥機(jī)制。旨在引起廣大醫(yī)務(wù)人員的重視,合理用藥,減少耐藥的發(fā)生。
方法:
首先對(duì)9株臨床分離的腸球菌及1株質(zhì)控菌株進(jìn)行鑒定和培養(yǎng),然后采用2009年CLSI標(biāo)準(zhǔn)推薦的瓊脂二倍稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),得到這10株腸球菌對(duì)利奈唑胺的MIC值。接下來(lái)進(jìn)行多步法誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn),就是將腸球菌依次接種在利奈唑胺濃度成倍增加的M
4、H瓊脂培養(yǎng)基中,初始濃度為1/4MIC,每個(gè)藥物濃度培養(yǎng)3~5代,當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)不良時(shí)可降低濃度重復(fù)傳代培養(yǎng),每個(gè)藥物濃度最多培養(yǎng)10代。對(duì)誘導(dǎo)出的耐藥菌株進(jìn)行瓊脂二倍稀釋法測(cè)定MIC值,比較誘導(dǎo)前后耐藥性變化。再對(duì)腸球菌23s rRNA基因V區(qū)域中第2332bp~720bp片段行PCR擴(kuò)增,如果該基因中存在G2576U突變就會(huì)被限制性內(nèi)切酶MaeI切為兩段,反之不能。應(yīng)用酶切、電泳的方法使野生基因與突變基因分離,再通過(guò)Tanon Gis(
5、天能)凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,得到耐藥菌中包含的G2576U突變數(shù)目。
結(jié)果:
上述9株臨床分離腸球菌以及質(zhì)控菌株經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)耐藥后,MIC值均顯著增高,分別增加了8~64倍,并經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)為穩(wěn)定的耐藥菌株。提示腸球菌經(jīng)過(guò)體外不斷地接受抗菌藥物的壓力,容易對(duì)利奈唑胺產(chǎn)生繼發(fā)耐藥,這與臨床工作中耐藥菌的迅速出現(xiàn)相吻合。糞腸球菌誘導(dǎo)前后的MIC值變化更大且所需的誘導(dǎo)代數(shù)更少,說(shuō)明糞腸球菌比屎腸球菌更容易發(fā)生
6、誘導(dǎo)耐藥。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出的穩(wěn)定耐藥株中均檢測(cè)出G2576U突變,且腸球菌MIC值隨著G2576U突變數(shù)量的增多而增高。這與Prystowsky,J.等人的研究吻合,說(shuō)明腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥與2576位的基因突變有關(guān),腸球菌的耐藥性與G2576U突變數(shù)量呈正相關(guān)。該突變位點(diǎn)位于23S rRNA基因可變區(qū)(V區(qū))的中心,是利奈唑胺的結(jié)合位點(diǎn),正是這個(gè)靶位的改變導(dǎo)致了腸球菌的耐藥。
結(jié)論:
利奈唑胺可誘導(dǎo)腸球菌產(chǎn)生獲
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