多重耐藥腸球菌耐藥基因篩選及傳播機(jī)制研究.pdf

1、腸球菌作為一種條件致病菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一,是引起心內(nèi)膜炎、菌血癥和尿路感染的重要致病菌.臨床上常采用細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合來(lái)治療腸球菌感染,但當(dāng)腸球菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶后會(huì)對(duì)高濃度氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥性,而在耐藥菌株中慶大霉素高水平耐藥 (high-levelgentamicin resistance.HLGR) 占了較大的比例,從而失去與細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物的協(xié)同作用,加大了治療的難度.特別是近年

2、出現(xiàn)的萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(vancomycin resistant enterococcus,VRE) 給臨床治療造成困難,引起廣泛重視.HLGR的出現(xiàn)系氨基糖苷類修飾酶所致,修飾酶的產(chǎn)生可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失,并可致多重耐藥.慶大霉素耐藥主要是由腸球菌中的耐藥基因aac(6')-Ie-aph(2")-Ia編碼一種修飾酶AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia引起.該修飾酶可介導(dǎo)對(duì)除鏈霉素以外的幾乎所有臨床使用的

3、氨基糖苷類抗生素的抗性,并可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失.另外還有新出現(xiàn)由aph(2")-Ic、aph(2")-Id及aph(2")-Ib基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2")-Ic、APH(2")-Id和APH(2")-Ib.APH(2")-Ic使腸球菌對(duì)慶大霉素呈中等水平耐藥,并破壞慶大霉素的協(xié)同作用.APH(2")-Id和APH(2")-Ib可導(dǎo)致對(duì)鏈霉素以外氨基糖苷類的高水平耐藥,但并不消除阿米卡星與細(xì)胞壁活性藥物的協(xié)

4、同作用.已有報(bào)道,腸球菌的慶大霉素高水平耐藥基因aac(6')-Ie-aph(2")-Ia及aph(2")-Ic基因等大多位于可接合的較大的質(zhì)粒上,也有位于接合轉(zhuǎn)座子上或不可轉(zhuǎn)移的染色體上,有些轉(zhuǎn)座子還可插入質(zhì)粒中和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移.因此,上述耐藥基因的檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)氨基糖苷類抗生素與細(xì)胞壁活性藥物合用的療效,而耐藥傳播機(jī)制的研究將有助于對(duì)耐藥性播散的控制.腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥可分為低水平耐藥(MIC 8-32μg/ml)和

5、高水平耐藥(MIC≥64μg/ml).根據(jù)腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥的誘導(dǎo)性,VRE分為6個(gè)表型,分別是VanA、VanB、VanC(C1、C2、C3)、VanD、VanE、VanG.其中以VanA和VanB型最為多見.萬(wàn)古霉素與腸球菌細(xì)胞壁上的五肽肽糖前體的羧基末端D-丙氨酸-D-丙氨酸結(jié)合形成復(fù)合體,阻止肽糖聚合所需的轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)肽反應(yīng),從而抑制腸球菌的細(xì)胞壁生物合成.而在萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(VRE)的細(xì)胞壁肽糖前

6、體末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸發(fā)生了改變,萬(wàn)古霉素不能與之相結(jié)合,因此不能抑制VRE的細(xì)胞壁合成.VanA耐藥常常與Tn1546樣元件同時(shí)存在.VanA型基因在不同的菌株間是高度保守的,但在Tn1546的整體結(jié)構(gòu)上,已發(fā)現(xiàn)有大量變異.許多變異歸因于轉(zhuǎn)座子內(nèi)不同插入序列(IS)元件的插入以及它們所引起的序列刪除.Tn1546因存在于接合性質(zhì)粒上而得到廣泛播散. 腸球菌是臨床較常見的一類細(xì)菌.近年來(lái)抗菌藥物的廣泛應(yīng)用以及各種侵入性

7、醫(yī)用裝置的使用,使得腸球菌所致的醫(yī)院感染逐漸增多.由于腸球菌對(duì)抗生素的耐藥性增加,尤其是HLGR及VRE的分離率在國(guó)內(nèi)迅速上升,給臨床治療造成了更大的難題.本研究分析了臨床分離到的HLGR、VRE菌株的克隆相關(guān)性、耐藥性、耐藥基因及耐藥傳播機(jī)制,為HLGR、VRE感染的防治提供基礎(chǔ).深入了解腸球菌的耐藥機(jī)制及耐藥性的傳遞特性,對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物和防止耐藥株的流行有著重要的意義. 1.腸球菌耐藥性研究 收集200

8、2年6月～2003年5月我院臨床分離的腸球菌106株.其中分離自腹腔引流液的最多,占26.4﹪(28/106);其次分離自膽汁,占20.8﹪(22/106);尿來(lái)源的居第三位,占18.9﹪(20/106);血液來(lái)源居第四位,占17.0﹪(18/106).提示腸球菌所致的感染中,以腹腔感染最常見,其次為膽道感染、泌尿系統(tǒng)感染及菌敗血癥.在所分離的腸球菌中,糞腸球菌和屎腸球菌的分離率最高,分別為45.3﹪(48/106)和43.4﹪(46/

9、106),共占總數(shù)的88.7﹪.采用K-B法及瓊脂稀釋法測(cè)定106株腸球菌對(duì)13種抗菌藥物的耐藥性,發(fā)現(xiàn)對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧沒有耐藥株;屎腸球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌;奎奴普丁/達(dá)福普汀對(duì)糞腸球菌的作用差,而對(duì)屎腸球菌有較強(qiáng)作用.所有腸球菌經(jīng)頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株,推測(cè)本院腸球菌對(duì)β一內(nèi)酰胺類抗生素耐藥主要是由于低親和力的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的過量產(chǎn)生.采用瓊脂篩

10、選法篩選出氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌(HLAR)78株,占73.6﹪,其中HLGR占64.29/0(68/106),HI,SR占45.3﹪(48/106). 2.慶大霉素高水平耐藥腸球菌耐藥基因及同源性研究 PCR檢測(cè)出68株HLGR中63株aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因陽(yáng)性,占92.6﹪;3株存在與aph(2")-Id高同源性的基因.50株住院病人分離的HLGR中,屎腸球菌的PFGE圖譜有8型(A-H

11、),以A型為主;糞腸球菌的PFGE圖譜有4型(A-D),呈多克隆散發(fā).提示HLGR己成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌,主要通過aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因編碼的修飾酶造成對(duì)慶大霉素高度耐藥. 3.新氨基糖苷類抗生素耐藥基因及傳播機(jī)制研究 鉛黃腸球菌H295為瓊脂稀釋法篩選所得的慶大霉素高水平耐藥菌株 (HLGR),于2002年7月由我院一位ICU住院病人腹腔引流液中分離得到的.本研究通過原始耐藥菌UZ95質(zhì)粒抽

12、提并酶切克隆測(cè)序及Southern雜交發(fā)現(xiàn)了與aph(2")-Id基因高度同源(核苷酸同源性為96.1﹪,氨基酸同源性為93.7﹪)的慶大霉素高水平耐藥新編碼基因aph(2")-Ie基因(GenBank登錄號(hào)AY 677166)位于一約16kb大小的質(zhì)粒上.在aph(2")-Ie基因的下游發(fā)現(xiàn)存在另一耐藥基因鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶str基因,屬于aad基因家族.該基因?qū)е聦?duì)鏈霉素及大觀霉素的耐藥,與腸球菌中3'-鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadE)基

13、因同源性較高,在乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌等中有報(bào)道,但在腸球菌中卻未見報(bào)道.質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白repD存在于兩個(gè)耐藥基因之間.耐藥基因可以通過整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列及某些未知的轉(zhuǎn)移機(jī)制在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移或集聚重排.本研究發(fā)現(xiàn)在aph(2")-Ie基因讀碼框的上游存在與IsEcpl高度相似的插入序列,含有轉(zhuǎn)座酶TnpA.該酶能夠特異識(shí)別和接合轉(zhuǎn)座子與靶點(diǎn)序列,可和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移.提示HLGR也可由一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的

14、APH(2")-Ie氨基糖苷類修飾酶所引起.aph(2")-Ie通過轉(zhuǎn)座酶與其他耐藥基因一起由質(zhì)粒傳播. 4.萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌耐藥基因及傳播機(jī)制研究 2006年5月～2007年4月在杭州市四家醫(yī)院收集到臨床分離的萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌16株耐藥表型均符合VanA型,基因型證實(shí)均為VanA型.多對(duì)引物對(duì)轉(zhuǎn)座子的不同區(qū)域的PCR擴(kuò)增并進(jìn)行序列拼接、比對(duì),發(fā)現(xiàn)VRE ZY21237的VanA基因位于轉(zhuǎn)座子Tn1546上,其它1

15、5株VRE菌株的 VanA 基因周圍序列與Tn1546相似,是一種未報(bào)道的Tn1546類似轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu).其中新的編碼轉(zhuǎn)座酶的插入序列(IS1485)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座功能.臨床分離的16株VRE菌株vanA基因均可通過濾膜接合進(jìn)行轉(zhuǎn)移.VRE菌株均由VanA基因所引起,可通過轉(zhuǎn)座子Tn1546與Tn1546類似轉(zhuǎn)座子在不同菌株或菌種之間進(jìn)行傳播.杭州市四家醫(yī)院分離的16株VRE菌株屬于7個(gè)不同型,并非單克隆播散,其中14株屬于適應(yīng)醫(yī)院環(huán)境

16、的克隆復(fù)合體(Clonal Complex17.CC17). 以上研究表明: 1. HLGR已成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌,主要通過aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因編碼的修飾酶造成對(duì)慶大霉素高度耐藥. 2. 住院病人分離的HLGR脈沖凝膠電泳分析,屎腸球菌HLGR主要為單克隆播散;糞腸球菌HLGR則呈多克隆散發(fā). 3. 新的慶大霉素高水平耐藥編碼基因aph(2")-Ie基因(GenBank登錄號(hào)