淫羊藿素通過(guò)PI3K-Akt和Nrf2通路拮抗肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究.pdf

1、目的：
　　研究補(bǔ)腎組分淫羊藿素對(duì)香煙煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）氧化應(yīng)激的影響，并從固有的抗氧化通路（PI3K-Akt和Nrf2通路）探討其機(jī)制。
　　方法：
　　(1)以2.5％，5％，10％ CSE刺激A549細(xì)胞，24小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，選出合適濃度的CSE進(jìn)行試驗(yàn);
　　(2)以1μ M，10μ M，100μM ICT干預(yù)A

2、549細(xì)胞，24小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，選出適合濃度的ICT進(jìn)行試驗(yàn)。
　　(3)以10μ M ICT預(yù)培養(yǎng)A549細(xì)胞1小時(shí)后加入5％、10％CSE刺激24小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，與單純CSE刺激組相對(duì)比。
　　(4)培養(yǎng)A549細(xì)胞，并分組。
　　A組:正常對(duì)照組;
　　B組:5％ CSE刺激模型組;
　　C組:IC

3、T10μ M干預(yù)組;
　　D組:ICT10μ M干預(yù)1小時(shí)后予5％ CSE刺激組;
　　E組:AKT抑制劑LY294002干預(yù)1小時(shí)后加ICT10μM干預(yù)1小時(shí)后予5％ CSE刺激組;
　　F組:Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入ICT10μM干預(yù)1小時(shí)后予5％ CSE刺激組;
　　(5)檢測(cè)指標(biāo)如下:
　　1)倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;
　　2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS變化;

4、r>　　3) GSH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH變化;
　　4) Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、P-Akt蛋白的變化;
　　5) Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GCLM mRNA變化。
　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度CSE均可抑制細(xì)胞增殖，且該作用呈濃度依賴性。
　　(2)中、低濃度(1μM，10μM)ICT對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用;高濃度(100μM) ICT對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。

5、　　(3)10μ M ICT對(duì)CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
　　(4) CSE可顯著引起細(xì)胞內(nèi)ROS釋放，而ICT提前干預(yù)則可降低ROS產(chǎn)生。
　　(5)與單獨(dú)CSE刺激組相比，ICT提前干預(yù)1小時(shí)可增加細(xì)胞內(nèi)GSH含量。
　　(6)與單獨(dú)CSE刺激組相比，ICT促進(jìn)GCLM基因轉(zhuǎn)錄，與此同時(shí)，Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt蛋白明顯增加。
　　(7)采用siRNA技術(shù)沉默Nrf2后，ICT對(duì)Nrf2

6、下游的抗氧化基因GCLM的轉(zhuǎn)錄無(wú)促進(jìn)作用。
　　(8)采用Akt抑制劑LY294002干預(yù)后，ICT對(duì)Nrf2的核轉(zhuǎn)位及其下游抗氧化基因GCLM的轉(zhuǎn)錄無(wú)促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)ROS的釋放無(wú)明顯抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.CSE可誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而引起細(xì)胞損傷和死亡。
　　2.補(bǔ)腎組分淫羊藿素是一種新型抗氧化劑，對(duì)于CSE誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可為COPD的抗氧化治療提供新選擇;