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文檔簡介
1、目的:研究濃度為10%的香煙煙霧提取物(CSE)在不同時期對大鼠氣管上皮細(xì)胞磷脂酰肌醇—3—激酶(phosphatidylinositol—3—kinase,PI3K)/Akt、不典型蛋白激酶Cι/ζ(aPKCι/ζ)、Nrf2(Nuclearfactor—E2relatedfactor)和γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ—GCS)的表達(dá)調(diào)控,闡明香煙煙霧對PI3K/Akt、aPKCι/ζ、Nrf2和核轉(zhuǎn)位的影響及對γ—GCS表達(dá)調(diào)控在氧化
2、/抗氧化機制中的作用。探討PI3K特異性抑制劑LY294002、aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220在香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激情況下對大鼠氣管上皮細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位和γ—GCS表達(dá)調(diào)控,闡明PI3K/Akt信號通路與aPKCι/ζ信號通路關(guān)系及PI3K/Akt、aPKCι/ζ對Nrf2的激活和核轉(zhuǎn)位及對γ—GCS的表達(dá)水平和活性的影響在氧化/抗氧化機制中的作用。 方法:實驗共分兩部分。將體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞用含20%F
3、CS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后隨機分為兩部分,一部分根據(jù)暴露10%CSE不同時期分為5組:Oh對照組,暴露1h,3h,6h,12h組(CSEOh,CSE1h,CSE3h,CSE6h,CSE12h)。另一部分也分為5組:Oh陰性對照組、CSE3h陽性對照組、LY294002組、R0—31—8220組和LY294002+R0—31—8220組,抑制劑組為在暴露CSE前0.5h加入10mMPI3K特異性抑制劑LY294002和/或3
4、uMaPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220培養(yǎng)3h。觀察香煙煙霧在不同時期、PI3K特異性抑制劑、aPKCι/ζ特異性抑制劑對大鼠氣管上皮細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位及γ—GCS的影響;用免疫熒光及Westernblot方法觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位和胞漿、胞核蛋白質(zhì)表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot方法檢測γ—GCS的表達(dá)水平;逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)方法分析γ—GCSmRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞技術(shù)、Westernblot方
5、法分析p—Akt蛋白質(zhì)表達(dá)水平和陽性細(xì)胞比率;Westernblot方法檢測aPKCι/ζ蛋白質(zhì)表達(dá)水平;參照Tietze方法測體外培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞還原型谷胱甘肽(GSH)的含量;參照雙酶法測體外培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞γ-GCS的活性。 結(jié)果: 第一部分: 1.體外培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞經(jīng)10%CSE處理后,GSH含量在1h降低,與對照組比較差異顯著(P<0.05);3h較對照組增高(P<0.05),6h達(dá)高峰;12h恢復(fù)
6、正常水平(P>0.05)。 2.Nrf2在對照組、CSE12h組主要表達(dá)在胞漿,然而,在CSE1h、3h、6h組主要表達(dá)在胞核;Nrf2胞核蛋白質(zhì)在對照組有一定表達(dá),暴露CSE后1h、3h、6h胞核蛋白質(zhì)高表達(dá),與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.05),但各組間表達(dá)無明顯差異,12h低表達(dá),與對照組無顯著性差異(P>0.05);Nrf2胞漿蛋白質(zhì)在對照組和CSE12h組高表達(dá),而在CSE1h、CSE3h、CSE6h組表達(dá)降低
7、,各組間表達(dá)無明顯差異,但與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.05)。 3.p-Akt蛋白質(zhì)在對照組弱表達(dá),當(dāng)暴露CSE后1h,其蛋白質(zhì)表達(dá)增高,3h達(dá)高峰,兩組與對照組比較差異顯著(P<0.05),6h降低,與對照組比較差異顯著(P<0.05),12h保持低水平。表達(dá)p-Akt陽性細(xì)胞比率逐漸增強,3h達(dá)到最高,然后逐漸減少,6h恢復(fù)正常,12h維持低比率。 4.p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)在CSE1h組開始表達(dá)增高,在
8、CSE3h組最高,約為正常的3倍,在CSE6h組表達(dá)減弱,三組與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.05),CSE12h組表達(dá)低水平,與對照組無明顯差異(P>0.05)。 5.RT-PCR結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞暴露于CSE,γ-GCSmRNA、蛋白質(zhì)和γ-GCS活性1h開始增強,3h明顯增強,6h達(dá)最高水平,12h表達(dá)減弱,與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。γ-GCS蛋白質(zhì)在對照組氣管上皮細(xì)胞胞漿中呈弱陽性表達(dá),CSE1h組、
9、CSE3h組呈陽性表達(dá),CSE6h組呈強陽性表達(dá),而CSE12h組呈弱陽性表達(dá)。 6.相關(guān)性分析示經(jīng)10%CSE處理后的氣管上皮細(xì)胞中,Nrf2與γ-GCS-h、γ-GCS活性、p-Akt和p-aPKCι/ζ呈正相關(guān),γ-GCS與GSH、γ-GCS活性、aPKCι/ζ及Nrf2呈正相關(guān),p-Akt與Pr-aPKCι/ζ及Nrf2成正相關(guān),p-aPKCι/ζ與γ-GCS、γ-GCS活性、p-Akt及Nrf2成正相關(guān)(P<0.05)
10、。 第二部分: 1.當(dāng)預(yù)先予以PI3K特異性抑制劑LY294002和/或aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220處理后,三組抑制劑組GSH含量較CS3h組減少(P<0.05),但比對照組高,有顯著性差異(P<0.05),三組抑制劑組之間無顯著性差異(P>0.05)。 2.Nrf2在對照組主要表達(dá)部位在胞漿,在LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組中主要表達(dá)部位在胞核,提示PI3K特異性抑制
11、劑LY294002和aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220不影響Nrf2核轉(zhuǎn)位。Nrf2胞核蛋白質(zhì)在對照組弱表達(dá),LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組表達(dá)增高,與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.05),而與CSE3h組無顯著性差異(P>0.05),三組抑制劑組之間無顯著性差異(P>0.05)。 3.γ—GCSmRNA、蛋白質(zhì)在對照組呈低表達(dá),LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組
12、較對照組表達(dá)增強(P<0.05),較CSE3h低(P<0.05),三組抑制劑組之間無顯著性差異(P>0.05)。γ—GCS蛋白質(zhì)在對照組氣管上皮細(xì)胞胞漿中呈弱陽性表達(dá),在LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組呈陽性表達(dá),CSE3h組呈強陽性表達(dá)。 4.在LY294002組,p—Akt蛋白質(zhì)和P—aPKCι/ζ蛋白質(zhì)都低表達(dá),在R0—31—8220組,p—Akt蛋白質(zhì)高表達(dá),而P—aPKCι/ζ低表達(dá)。在LY29
13、4002組,表達(dá)p—Akt陽性細(xì)胞比率降低,在R0—31—8220組,表達(dá)p—Akt陽性細(xì)胞比率增高。 結(jié)論: 1.香煙煙霧調(diào)節(jié)γ—GCS表達(dá)和GSH合成。 2.體外培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧提取物處理后的一定時期Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位,說明在氧化應(yīng)激情況下,Nrf2可能是調(diào)控γ—6CS表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。 3.PI3k特異性抑制劑和aPKCι/ζ特異性抑制劑影響γ—GCS蛋白質(zhì)、γ—GCSmRNA表達(dá)、γ
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