白三烯誘導(dǎo)人呼吸道上皮細胞氧化應(yīng)激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究.pdf

1、支氣管哮喘為一種慢性氣道炎癥性疾病，哮喘肺局部及外周血均存在氧化應(yīng)激，并與疾病嚴重程度有相關(guān)性。白三烯是哮喘病理生理中最重要的介質(zhì)之一，可以誘發(fā)支氣管收縮、呼吸道炎癥、水腫及粘液分泌增加。呼吸道上皮細胞作為呼吸道的第一道屏障，具有清除氧自由基的機制，可以抵抗細胞內(nèi)趨向氧化狀態(tài)的變化，保持氧化還原穩(wěn)定狀態(tài)。谷胱甘肽（GSH）構(gòu)成了細胞免受氧化損傷的第一道防線，對氣道和肺泡上皮細胞具有重要的保護作用。GSH與自由基反應(yīng)而成為氧化型GSH （

2、GSSG），從而保護組織、細胞免受自由基攻擊和損傷。GSH/GSSG 可作為為衡量氧化應(yīng)激水平的重要指標，該比值下降表明存在氧化應(yīng)激。谷胱甘肽(GSH)是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)在細胞內(nèi)催化兩步反應(yīng)而合成，前者是GSH 合成限速酶。細胞內(nèi)γ-GCS 活性升高使GSH 合成加速，從而提高細胞內(nèi)外GSH濃度。本實驗中，我們研究LTC4是否誘導(dǎo)氧化應(yīng)激影響呼吸道上皮細胞谷胱甘肽氧化還原平衡，以及呼吸道上皮

3、細胞是否可以通過提高γ-GCS 活性對抗氧化應(yīng)激以保持氧化還原穩(wěn)定狀態(tài)。
　　 研究目的：研究白三烯誘導(dǎo)人呼吸道上皮細胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)變化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的作用。
　　 研究方法：人氣道上皮細胞分為2組，①對照組：人氣道上皮細胞；②暴露組：人氣道上皮細胞白三烯暴露2h、4h、6h、12h。檢測對照組及白三烯暴露組2h、4h、6h、12h 相應(yīng)指標：測定氣道上皮細胞內(nèi)GSH和GSSG 含量；

4、雙酶法測定γ-GCS 活性；RT-PCR 檢測氣道上皮細胞中γ-GCS-mRNA表達；Western blot 檢測氣道上皮細胞核和細胞質(zhì)中γ-GCS蛋白表達；細胞免疫熒光法檢測氣道上皮細胞γ-GCS蛋白表達。
　　 研究結(jié)果：①暴露組2h、4h、6h、12h GSH含量、GSH/GSSG 比值先減少后逐漸增加，于4h 最低，6h 達最高，12h 恢復(fù)正常，而GSSG 含量則呈現(xiàn)相反趨勢，與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②暴露2h

5、、4h、6h組與對照組比較，γ-GCS 活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。③氣道上皮細胞γ-GCS蛋白表達：a、細胞免疫熒光法檢測結(jié)果：γ-GCS蛋白陽性信號主要分布在胞質(zhì)中，暴露組氣道上皮細胞中呈強陽性表達，而對照組相應(yīng)部位表達較弱。暴露組2h、4h、6h組γ-GCS蛋白與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B、Wes tern blot檢測結(jié)果：結(jié)果相似。④RT-PCR 檢測氣道上皮細胞中γ-GCS-mRNA表達結(jié)果：暴露組2h、4h、6h組γ