甘氨酰tRNA合成酶對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、隨著人們對食品安全認(rèn)識的不斷加深，使得乳品質(zhì)的好壞和產(chǎn)奶量的高低得到更廣泛的關(guān)注。研究泌乳相關(guān)信號通路，探尋與泌乳相關(guān)的重要調(diào)控分子，有利于為奶牛乳品質(zhì)和乳產(chǎn)量的提高，提供實驗依據(jù)及新途徑。甘氨酰tRNA合成酶（GlyRS）是重要的氨基酰tRNA合成酶（aaRSs）家族成員。研究發(fā)現(xiàn)aaRSs存在多種經(jīng)典翻譯功能之外的信號調(diào)控作用。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于GlyRS在奶牛乳腺發(fā)育過程中表達(dá)及調(diào)節(jié)的研究尚未見報道。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)GlyRS與

2、BMECs乳蛋白的合成有關(guān)。本實驗旨在闡明GlyRS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）乳蛋白、乳脂、乳糖以及細(xì)胞增殖的影響。從而初步揭示GlyRS是一個新的調(diào)節(jié)BMECs乳合成的信號分子。
　　本研究采用了組織塊培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)并得到了純化的BMECs。利用免疫熒光(IF)和蛋白質(zhì)免疫印記(WB)檢測細(xì)胞中角蛋18(CK18)和β-Casein(CSN2)的表達(dá)，以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。
　　實驗通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加0.

3、6mmol/L的蛋氨酸(Met)或10％的胎牛血清(FBS)建立一個體外細(xì)胞培養(yǎng)的泌乳模型。采用WB、IF以及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)等方法，檢測添加Met或FBS后，乳糖和乳脂(TG)的分泌量，DNA數(shù)量，CSN2、GlyRS、p-GlyRS(T544，S704)的表達(dá)量以及p-GlyRS(T544，S704)的定位情況。結(jié)果表明，添加Met或FBS可以促進(jìn)細(xì)胞乳糖和乳脂的分泌，增加DNA合成，顯著提高CSN2、GlyRS

4、以及p-GlyRS(T544，S704)的表達(dá)量，同時發(fā)現(xiàn)p-GlyRS(T544，S704)在細(xì)胞核中定位明顯增加。這表明，在Met或FBS可以通過GlyRS調(diào)節(jié)BMECs乳合成以及細(xì)胞增殖。
　　利用純化后的BMECs分別建立GlyRS過表達(dá)（pGCMV-IRES-EGFP-GlyRS）與干擾(GlyRS shRNA)的細(xì)胞泌乳模型，采用WB、IF、qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)等方法，檢測

5、乳糖和乳脂的分泌量，DNA數(shù)量，細(xì)胞周期的分布以及GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、SREBP-1、CSN2、CyclinD1和β-1，4-galactosyltransferase2（β4Gal-T2）的表達(dá)。結(jié)果表明，當(dāng)GlyRS過表達(dá)和抑制時，乳糖和乳脂的分泌量，細(xì)胞的DNA合成，處于S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)分別顯著增加和降低。同時，GlyRS、p-

6、GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1和CSN2的蛋白表達(dá)水平以及β4Gal-T2的mRNA表達(dá)量也均顯著增加和降低。然而，mTOR和S6K1的蛋白表達(dá)水平無顯著變化。這表明，GlyRS通過上調(diào)p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1以及β4Gal-T2的表達(dá)量，促進(jìn)乳蛋白、乳脂以及乳