miR-139對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、miRNAs是一類單鏈的在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，能參與生物體的多項(xiàng)生理活動。miR-139在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起作用，且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于miR-139調(diào)節(jié)奶牛乳腺發(fā)育及泌乳功能研究的報(bào)道。本研究以中國荷斯坦奶牛為實(shí)驗(yàn)動物，以泌乳中期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，確定miR-139及其靶基因的表達(dá)與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳之間的關(guān)系，明確miR-139在奶牛乳腺發(fā)育和泌乳中的調(diào)節(jié)作用，為人工調(diào)節(jié)乳產(chǎn)量提

2、供理論依據(jù)。
　　本研究先在TargetScan（http://www.targetscan.org）網(wǎng)站上進(jìn)行靶基因預(yù)測，然后選擇GHR和IGF-IR作為miR-139的目標(biāo)靶基因;之后以中國荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-139、GHR和IGF-IR在奶牛不同發(fā)育階段及不同乳品質(zhì)乳腺組織中的表達(dá)變化，用Western blotting方法檢測GHR在奶牛不同發(fā)育階段及不同乳品質(zhì)乳腺組織中的表達(dá)變化

3、;接下來以體外培養(yǎng)的泌乳中期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對象，分別轉(zhuǎn)染miR-139 mimic和inhibitor，采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-139、GHR和IGF-IR的表達(dá)變化;用Western blotting方法檢測IGF-IR及泌乳相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)變化;分別用MTT法檢測細(xì)胞活性、Edu細(xì)胞增殖試劑盒檢測DNA增殖情況;用相關(guān)試劑盒分別檢測miR-139過表達(dá)和抑制后β-酪蛋白、甘油三酯以及乳糖的含量;最后用mi

4、R-139 inhibitor和GHR siRNA同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行miR-139和GHR共抑制實(shí)驗(yàn)，并在mRNA或蛋白水平檢測GHR、IGF-IR以及泌乳相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果表明:
　　(1)干奶期奶牛乳腺組織中的miR-139及其靶基因GHR和IGF-IR的mRNA表達(dá)顯著高于泌乳期（P＜0.05）;泌乳期高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的miR-139及GHR的mRNA表達(dá)顯著高于低乳品質(zhì)奶牛(P＜0.05

5、)，但是GHR的蛋白表達(dá)在泌乳期高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中沒有顯著差異;泌乳期高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的IGF-IR的mRNA表達(dá)顯著低于低乳品質(zhì)奶牛(P＜0.05)。
　　(2) miR-139過表達(dá)能顯著下調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中GHR、IGF-IR、STAT5、p-STAT5、PPARγ、 SREBP1、 Cyclin D1、p-70S6K、p-p70S6K、AKT1、p-AKT1、mTOR、p-mTOR的表達(dá)(P＜0.05);

6、miR-139抑制實(shí)驗(yàn)則表現(xiàn)出相反結(jié)果(P＜0.05)，說明miR-139能通過調(diào)節(jié)其靶基因GHR和IGF-IR進(jìn)而調(diào)節(jié)泌乳相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)。
　　(3) miR-139過表達(dá)顯著抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力、增殖能力以及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成（P＜0.05）;miR-139抑制實(shí)驗(yàn)則表現(xiàn)出相反結(jié)果(P＜0.05)。
　　(4) miR-139和GHR共抑制組與GHR沉寂組相比，GHR、IGF-IR、AKT1