奶牛乳腺上皮細(xì)胞中賴氨酸蛋氨酸配比模式對(duì)酪蛋白合成的影響及機(jī)理研究.pdf

1、本研究的主要目的是以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究賴氨酸、蛋氨酸及賴氨酸蛋氨酸配比模式對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響,旨在探討體外培養(yǎng)條件下乳蛋白合成的最佳賴氨酸蛋氨酸配比模式,揭示在最佳配比模式下轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上影響乳蛋白合成的分子機(jī)制,以提高乳中乳蛋白的含量,從而為改善牛奶質(zhì)量提供理論依據(jù)。研究包括三部分:
　　 1.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,利用噻唑藍(lán)(MTT)法來探討不同濃度梯度的賴氨酸

2、、蛋氨酸添加水平及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響,得出賴氨酸、蛋氨酸作用的最佳濃度范圍和最優(yōu)的培養(yǎng)時(shí)間為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做參考,同時(shí)也為闡明二者提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì),賴氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mmol／L,蛋氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6

3、、3.2、6.4、12.8mmol／L;培養(yǎng)期為24、48和72h。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明:賴氨酸在0.8～1.6mmol／L、蛋氨酸在0.4～0.8mmol／L濃度范圍內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯且在48h時(shí)增殖作用最強(qiáng)(P<0.01)。
　　 2.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究添加賴氨酸、蛋氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成的影響。試驗(yàn)選擇七種水平的賴氨酸(0、0.4、0.8、1.2、

4、1.6、2.0、2.4mmol／L)和六種水平的蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol／L)為處理組。試驗(yàn)期為48h,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)3次。采用ELISA方法檢測試驗(yàn)組乳腺上皮細(xì)胞中總酪蛋白的含量。通過擬合曲線得出最佳的賴氨酸、蛋氨酸添加水平,同時(shí)采用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)染色法檢測賴氨酸、蛋氨酸在最佳添加水平時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響；并采用Real-Time P

5、CR技術(shù)檢測此水平下編碼乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-1和ASCT-2的表達(dá)。結(jié)果表明:1)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),賴氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線y=-0.336X2+0.792X+1.983(R2=0.965),得出賴氨酸的最佳添加濃度為1.2mmol／L。此水平下,與對(duì)照組相比促進(jìn)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。αs1-酪蛋白(αs1--casein,CSN1S1)、αs

6、2-酪蛋白(αs2-casein,CSN1S2)、β-酪蛋白(β-casein,CSN2)、κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin,LALBA)基因表達(dá)均上調(diào),且與未添加賴氨酸的對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-1基因的表達(dá)上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT5-JAK2信號(hào)通路的基因,信號(hào)轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transdu

7、cers and activators of transcription5,STAT5)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(Janus Kinases2,JAK2)、ets結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子5(ets domain transcription factor,ELF5)表達(dá)均顯著上調(diào),且STAT5和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素標(biāo)靶(mammalian target ofrapamycin,mTOR)信號(hào)通路的基因m

8、TOR和p70核糖體蛋白S6激酶(ribosomal proton S6 kinase-1,S6K)基因的表達(dá)均上調(diào)且mTOR差異極顯著(P<0.01),但真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1,EIF4E-BP1)表達(dá)下調(diào)。2)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),蛋氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線),y=-2.736X2+2.

9、851X+1.984(R2=0.95),得出蛋氨酸的最佳添加濃度為0.5mmol／L。此水平下,與對(duì)照組相比促進(jìn)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達(dá)均上調(diào):除CSN2外,其他基因與未添加蛋氨酸的對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體ASCT-2基因的表達(dá)上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STATS-JAK2信號(hào)通路的基因STATS、JAK2、ELF5

10、表達(dá)均顯著上調(diào),且STATS和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的mTOR信號(hào)通路的基因mTOR和S6K基因的表達(dá)均上調(diào)但差異不顯著,但EIF4E-BP1表達(dá)下調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。
　　 3.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究賴氨酸蛋氨酸配比模式對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成的影響。試驗(yàn)采用3×5復(fù)因子試驗(yàn)設(shè)計(jì),以蛋氨酸(0.4、0.5、0.6mmol／L)和賴氨酸(1.0、1.2、1

11、.4、1.5、1.6mmol／L,)的混合物作為試驗(yàn)處理。試驗(yàn)期為48h,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)3次。通過ELISA方法檢測添加蛋氨酸和賴氨酸混合物后細(xì)胞中酪蛋白的合成量。得出最佳的賴氨酸蛋氨酸配比模式,并采用Real-Time PCR技術(shù)檢測此水平下乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及與賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-1和ASCT-2的表達(dá)。結(jié)果表明:蛋氨酸(0.4mmol／L)和賴氨酸(1.2mmol／L)混合添

12、加時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總酪蛋白合成量最高為2.95ppm,并差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸以1.2mmol／L和0.4mmol／L即3:1混合添加時(shí)在不影響賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-1和ASCT-2基因表達(dá)的條件下(P>0.05)均能極顯著地促進(jìn)乳蛋白基因的表達(dá)如:CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達(dá)均上調(diào)(P<0.01),且CSN1S1和LABA表達(dá)量最高。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT