蛋氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)影響.pdf

1、乳產(chǎn)量和乳蛋白含量低一直是制約著我國(guó)奶牛業(yè)發(fā)展的重要因素，深入研究泌乳調(diào)控機(jī)理對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。蛋氨酸是乳蛋白合成的重要前體物質(zhì)，以往的研究主要側(cè)重于蛋氨酸對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響，而關(guān)于蛋氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳調(diào)控作用研究較少。研究蛋氨酸與乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的關(guān)系，尋找奶牛乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中與泌乳相關(guān)的重要蛋白質(zhì)，將有助于從蛋白質(zhì)水平揭示乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制。
　　 本研究成功構(gòu)

2、建體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型，添加不同濃度的蛋氨酸后，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞的乳糖分泌情況，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)蛋氨酸對(duì)β-酪蛋白mRNA表達(dá)水平的影響，應(yīng)用細(xì)胞活力分析儀(CASY)來(lái)檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞增殖及活力的變化，甘油三酯試劑盒檢測(cè)甘油三酯含量，確定蛋氨酸的最佳添加濃度，并進(jìn)一步應(yīng)用雙向電泳技術(shù)分析體外培養(yǎng)的蛋氨酸處理組與對(duì)照組奶牛乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組。利用Image M

3、aser2D軟件對(duì)圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)基中蛋氨酸的添加濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)，蛋氨酸在1.2mmol/L時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯(P<0.01)，是體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的最佳添加濃度。
　　 (2)利用雙向電泳技術(shù)

4、建立了對(duì)照組和蛋氨酸處理組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)圖譜，獲得了分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜。篩選出了對(duì)照組和蛋氨酸處理組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)并進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。利用Image Maser2D軟件對(duì)圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，成功鑒定出5個(gè)在蛋氨酸處理組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)，分別是Carnitineacetyltransferase、Dihydropyrimidinase-related protein2、Ornithi

5、ne aminotransferase、NADHdehydrogenase[ubiquinone] flavoprotein2及Apolipoprotein A-I-binding protein，這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的功能涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝及細(xì)胞骨架構(gòu)成等生物學(xué)功能。
　　 (3)進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)在mRNA水平驗(yàn)證2-DE結(jié)果。5種差異蛋白質(zhì)均在高泌乳水平奶牛乳腺組織中表達(dá)量最高，低泌乳水平奶牛次之，干奶期奶牛