槲皮素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、本試驗(yàn)使用不同濃度雌二醇、槲皮素單獨(dú)作用及共同作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞，對比三種處理下細(xì)胞抗氧化性及相關(guān)基因的表達(dá)水平，并通過建立H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，進(jìn)一步研究槲皮素在氧化應(yīng)激下對細(xì)胞的保護(hù)功能。本試驗(yàn)分為三個(gè)部分:
　　 一、雌激素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性及HSP70 mRNA表達(dá)量的影響
　　 試驗(yàn)分溶劑對照組(CK)和Ⅰ～Ⅴ濃度分別為0.5、1、5、10、100 nmol/L雌二醇(E2)處理組，培養(yǎng)奶牛乳

2、腺上皮細(xì)胞4h、8h和12 h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率情況，比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)，比色法和熒光定量RT-PCR法分別檢測培養(yǎng)12h各組細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及HSP70mRNA表達(dá)量，旨在篩選體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞雌激素較適添加濃度。結(jié)果顯示:(1)與對照組相比，Ⅰ～Ⅲ組細(xì)胞存活率升高(P＜0.05);Ⅳ～Ⅴ組細(xì)胞存活率降低且培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高(P＜0.01)。(2)Ⅰ

3、～Ⅳ組細(xì)胞中HSP70mRNA表達(dá)量、SOD活性高于對照組(P＜0.05);Ⅴ組乳腺細(xì)胞的HSP70 mRNA表達(dá)量、SOD活性低于對照組(P＜0.05)。結(jié)論:低濃度E2能夠上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的存活率，誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中HSP70mRNA表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)SOD活性發(fā)揮抗氧化作用，長期處于高濃度E2環(huán)境下，下調(diào)乳腺細(xì)胞存活率，降低抗氧化性并引起細(xì)胞損傷，5 nmol/L E2可作為體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞較適添加濃度。
　　

4、 二、槲皮素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性及HSP70、Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)量的影響
　　 試驗(yàn)分溶劑對照組(CK)和Ⅰ～Ⅴ濃度分別為12.5、25、50、100、200μmol/L槲皮素(Que)處理組，培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞4h、8h和12 h后，檢測細(xì)胞存活率情況;檢測培養(yǎng)12h后丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)活性和Hsp70、Bcl-2/Bax mRNA的表達(dá)量的變化。結(jié)果表明

5、:與CK組相比，Ⅰ～Ⅲ組呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)細(xì)胞存活率，上調(diào)SOD活性和胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)量，下調(diào)MDA合量及胞外LDH活性，Ⅴ組各檢測值則呈完全相反的變化(P＜0.05)。結(jié)論:12.5～50μmol/L皮素能夠上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力，發(fā)揮保護(hù)作用，100～200μmol/L槲皮素結(jié)果相反，發(fā)揮抗雌激素作用。
　　 三、槲皮素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞雙雌激素樣作用及抗氧化應(yīng)激作用的研究

6、　　 試驗(yàn)分為溶劑對照組(CK)、5 nmol/L E2對照組、5 nmol/L E2分別與12.5、25、50、100、200μmol/L Que共同作用試驗(yàn)組(Ⅰ～Ⅴ)，在培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞4h、8h、12h后檢測細(xì)胞存活率情況;檢測培養(yǎng)12h后MDA含量、SOD、LDH活性及HSP70 mRNA的表達(dá)量。H2O2損傷組:含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液作用乳腺上皮細(xì)胞4h后，換常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12h; Que前保護(hù)組:含5

7、0μmol/L Que的培養(yǎng)液作用于乳腺上皮細(xì)胞12h后，換含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)4h; Que后保護(hù)組:含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液作用乳腺上皮細(xì)胞4h后換含50μmol/L Que的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，對各組細(xì)胞MDA、SOD、LDH進(jìn)行檢測。旨在進(jìn)一步研究Que對氧化應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)作用以及其在不同E2水平對健康奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率、抗氧化性及HSP70 mRNA表達(dá)的影響，并篩選出在不同E2水平下槲皮