甘氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及免疫因子基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、本研究是以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，探究甘氨酸(Gly)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡以及免疫應(yīng)答的影響。試驗(yàn)分別測(cè)定了Gly培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞凋亡率以及四種免疫因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的基因表達(dá)量，旨在闡明Gly是否參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程以及對(duì)乳腺上皮細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的影響。本論文的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、膠原酶消化法分離出奶牛乳腺上

2、皮細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加0、1、2、5、10和20 mmol/L的Gly后在體外條件下培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，Gly對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖活性有低濃度(1mmol/L)促進(jìn)，高濃度(10-20 mmol/L)顯著抑制的作用(P＜0.05)。
　　2、使用流式細(xì)胞儀技術(shù)，應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)不同濃度Gly（0、1、2、5、10和20 mmol/L）培養(yǎng)后的奶牛乳腺上皮

3、細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gly能夠顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化(P＜0.05)，并促進(jìn)細(xì)胞分裂。
　　3、使用流式細(xì)胞儀技術(shù)，應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)不同濃度Gly（0、1、2、5、10和20 mmol/L）培養(yǎng)后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，Gly對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用(P＜0.05)，本試驗(yàn)中，Gly濃度為20 mmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率最大。
　　4、不同濃度Gl

4、y（0、1、2、5、10和20 mmol/L）培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，提取出總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用Real-Time PCR法檢測(cè)免疫因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的基因表達(dá)量，所得PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的能力，Gly可以顯著上調(diào)這四種免疫因子的基因表達(dá)水平(P＜0.05)，Gly濃度為5 mmol/L時(shí)，對(duì)這