苯并（a）芘及大蒜素對(duì)大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL-149γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的影響.pdf

1、吸煙所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是COPD重要的發(fā)病機(jī)制之一。谷胱甘肽(GSH)是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是GSH合成的限酶，通過調(diào)節(jié)γ-GCS的表達(dá)可以調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡狀況，同時(shí)也能為臨床治療提供新的思路。本課題的研究目的：1、研究香煙的重要成分苯并(a)芘(B(a)P)是否通過影響γ-GCS的表達(dá)參與氧化/抗氧化失衡從而參與COPD的發(fā)病。2、尋找有效的抗氧化治療藥物。本研究分兩部分：一、B(a)P對(duì)

2、大鼠肺泡上皮細(xì)胞(CCL-149)γ-GCS的調(diào)控作用；二、大蒜素對(duì)CCL-149細(xì)胞γ-GCS的作用。 第一部分：B(a)P對(duì)大鼠肺泡上皮細(xì)胞(CCL-149)γ-GCS的影響目的：研究香煙中的重要成分B(a)P是否通過影響γ-GCS的表達(dá)參與氧化/抗氧化失衡從而參與COPD的發(fā)病過程。方法：一、MTT法觀察不同濃度B(a)P(100ng/ml、500ng/ml、5000ng/ml)在不同時(shí)間(24h、36h、48h、72h)

3、對(duì)CCL-149生長(zhǎng)的影響，確定作用細(xì)胞的合適濃度。二、用EMSA(supershift)方法證明B(a)P刺激能夠使AhR-ARNT(芳香烴受體-芳香烴核轉(zhuǎn)位因子)形成異源二聚體，并結(jié)合E-box元件。三、B(a)P對(duì)CCL-149γ-GCS的影響：l、觀察B(a)P對(duì)細(xì)胞γ-GCS基因轉(zhuǎn)錄水平的影響：(1)、將GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CCL-149細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換用含血清培養(yǎng)基為計(jì)時(shí)點(diǎn)，于換

4、培養(yǎng)基后2h、6h、12h、24h檢測(cè)熒光素酶活性觀察E-box元件的負(fù)性調(diào)控作用。(2)不同濃度B(a)P(2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml)作用于GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc表達(dá)載體，刺激不同的時(shí)間(2h、6h、12h、24h)觀察其對(duì)γ-GCS表達(dá)水平的影響。(3)、用大鼠重組細(xì)胞因子TNF-α作為陽性對(duì)照，觀察結(jié)果。(4)、用TCDD(10pmol/L)刺激轉(zhuǎn)染GCLC-luc及GCLC-d

5、elE-box-luc表達(dá)載體的大鼠肺泡上皮細(xì)胞，于不同的時(shí)間(2h、6h、12h、24h)檢測(cè)其熒光素酶活性變化。2、B(a)P(20ng/ml、200ng/ml)刺激細(xì)胞(6h、12h、24h)，提取總蛋白用WesternBlot檢測(cè)GCLC蛋白的變化。3、B(a)P(200ng/ml)刺激后(3h、6h、12h、24h、48h)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH的變化。四、以NIH3T3為模型轉(zhuǎn)染GCLC-luc，B(a)P(200ng/ml)作用

6、后(2h、6h、12h、24h、48h)檢測(cè)其熒光素酶活性的變化。五、B(a)P對(duì)GCLC基因上游的其他調(diào)控元件作用的研究及實(shí)驗(yàn)誤差的排除：1、將含有NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄因子通用調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的載體轉(zhuǎn)染入CCL-149，用B(a)P(200ng/ml)作用細(xì)胞(2h、6h、12h、24h)后觀察其對(duì)NF-κB及AP-1兩個(gè)正性調(diào)控位點(diǎn)的作用。2、按GCLC上游調(diào)控序列重構(gòu)含E-box元件、CDXA元件及CDXA-E-box元件三個(gè)重組

7、載體，將這些載體分別轉(zhuǎn)染入CCL-149細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后予B(a)P200ng/ml刺激細(xì)胞2h、6h、12h、24h，通過熒光素酶活性測(cè)定觀察B(a)P對(duì)于E-box元件、CDXA元件以及E-box-CDXA的聯(lián)合元件的協(xié)同作用來發(fā)揮作用。3、將GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc分別送檢測(cè)序。結(jié)果：一、MTT法表明B(a)P的刺激濃度在5000ng/ml以上時(shí)嚴(yán)重影響CCL-149的生長(zhǎng)(P＜0.01)，本課題根據(jù)

8、MTT結(jié)果及參考文獻(xiàn)常用劑量，選用小于500ng/ml的B(a)P作為刺激濃度。二、Supershift證實(shí)B(a)P刺激能夠使AhR-ARNT形成異源二聚體，并結(jié)合E-box元件。三、1、B(a)P在總的轉(zhuǎn)錄水平不影響γ-GCS的表達(dá)：(1)、缺失E-box元件的GCLC-delE-box-luc其熒光素酶活性較GCLC-luc明顯增高(P＜0.05)。(2)、不同濃度(2ng/ml、20ng/ml、200ng/ml)B(a)P刺激不

9、同的時(shí)間(2h、6h、12h、24h)不影響GCLC-luc及GCLC-delE-box-luc的表達(dá)(P＞0.05)。(3)、用TNF-α作為陽性對(duì)照的結(jié)果提示TNF-α刺激12h、24h明顯增強(qiáng)γ-GCS的表達(dá)(P＜0.05)。(4)、TCDD(10pmol/L)刺激不同的時(shí)間(2h、6h、12h、24h)不影響熒光素酶活性(P＞0.05)，提示TCDD對(duì)γ-GCS表達(dá)水平無影響。2、WesternBlot檢測(cè)結(jié)果提示苯并芘刺激組在

10、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)GCLC蛋白的變化與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)，TNF-α在刺激24小時(shí)GCLC蛋白表達(dá)較對(duì)照明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。3、B(a)P(200ng/ml)刺激后(3h、6h、12h、24h、48h)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH的變化與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)。四、用NIH3T3轉(zhuǎn)染的結(jié)果表明苯并芘刺激組與對(duì)照組比較熒光素酶活性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。五、B(a)P對(duì)GCLC基因上游其他調(diào)控元件的作用研究

11、：1、B(a)P作用后NF-κB-luc和AP-1-luc的熒光素酶活性較對(duì)照組相比較，其熒光素酶活性的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果表明B(a)P不通過NF-κB及AP-1兩個(gè)調(diào)控位點(diǎn)起作用。2、經(jīng)測(cè)序后證實(shí)成功構(gòu)建E-box-PGL3、CDXA-PGL3以及CDXA-E-box-PGL3三個(gè)重組質(zhì)粒。苯并芘對(duì)這三個(gè)重組質(zhì)粒的熒光素酶活性較對(duì)照組相比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明B(a)P不通過E-box元件、G

12、CLC基因E-box元件上游的調(diào)控元件CDXA及E-box-CDXA的兩個(gè)調(diào)控元件的協(xié)同作用調(diào)控γ-GCS的表達(dá)(P＞0.05)。3、測(cè)序結(jié)果正確。結(jié)論：B(a)P刺激能夠使AhR-ARNT形成異源二聚體，并結(jié)合E-box元件；在總的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平B(a)P不影響γ-GCS的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)；在CCL-149中，B(a)P原形不影響細(xì)胞內(nèi)的GSH水平；成功構(gòu)建三個(gè)重組載體，對(duì)這些載體熒光素酶活性檢測(cè)表明B(a)P不影響E-bo

13、x元件的表達(dá)。 第二部分：大蒜素對(duì)大鼠肺泡上皮細(xì)胞γ-GCS的影響目的：尋找有效的抗氧化治療藥物。方法：一、MTT法觀察不同濃度的大蒜素(0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)在不同時(shí)間(24h、36h、48h、72h)對(duì)CCL-149生長(zhǎng)的影響，確定合適的作用濃度。二、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)刺激細(xì)胞，作用后6h、12h、24h、48

14、h檢測(cè)CCL-149細(xì)胞內(nèi)GSH含量的變化。三、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μ/ml)分別刺激細(xì)胞6h、12h、24h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用Western印跡實(shí)驗(yàn)觀察大蒜素對(duì)CCL-149細(xì)胞γ-GCS蛋白表達(dá)的影響。四、用大蒜素作用于轉(zhuǎn)染不同調(diào)控位點(diǎn)的報(bào)告基因載體(GCLC-delE-box-luc、CDXA-PGL3、E-box-PGL3、CDXA-E-box-PGL3、AP-1-luc、N

15、F-κB-luc)的CCL-149，觀察大蒜素可能的作用位點(diǎn)。五、用大蒜素(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml)刺激細(xì)胞，作用后6h、12h、24h、48h檢測(cè)CCL-149細(xì)胞內(nèi)MDA含量的變化。結(jié)果：一、MTT結(jié)果顯示大蒜素濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)引起細(xì)胞死亡(P＜0.01)，本課題根據(jù)MTT結(jié)果及參考文獻(xiàn)常用劑量，選用大蒜素小于等于5μg/ml作為刺激濃度。二、不同濃度大蒜素(0.1μg/ml、1.

16、0μg/ml、5.0μg/ml)處理CCL-149后細(xì)胞內(nèi)γ-GCS的蛋白表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(P＜0.05)，未表現(xiàn)劑量依賴性(P＞0.05)。三、1、通過報(bào)告基因系統(tǒng)表明大蒜素(1.0μg/ml)能上調(diào)GCLC的基因表達(dá)(P＜0.05)。2、通過報(bào)告基因系統(tǒng)表明大蒜素(1.0μg/ml)不影響AP-1結(jié)合元件，E-box元件、E-box-CDXA聯(lián)合元件的表達(dá)；能促進(jìn)CDXA元件的表達(dá)(P＜0.05)；在2h、6h抑制NF-κB元件的表