花粉介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)花青素基因NtAN2的研究及大蒜半胱氨酸合成酶性質(zhì)的研究.pdf

1、利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將花青素基因NtAn2導(dǎo)入玉米自交系鄭58。優(yōu)化超聲波輔助花粉介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化方法的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以新鮮的鄭58玉米花粉為試驗(yàn)材料，檢測(cè)其在不同濃度的蔗糖溶液中的體外萌發(fā)率;通過(guò)正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)超聲波處理功率、處理時(shí)間、處理次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化;通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)農(nóng)桿菌菌液濃度、超聲波處理參數(shù)、蔗糖用液濃度、AS濃度四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化確定最有效的轉(zhuǎn)化組合。然后將NtAN2通過(guò)花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至玉米自交系鄭58中。對(duì)收獲的籽粒

2、的植株后代進(jìn)行PCR檢測(cè)、Dot blot雜交分析、southern blot雜交分析以及轉(zhuǎn)基因植株花青素含量的測(cè)定比較與分析。結(jié)果表明：玉米自交系鄭58的花粉最適宜的蔗糖溶液濃度為20％;超聲波處理最佳參數(shù)為:處理功率為150w,處理時(shí)間為5s/次，處理次數(shù)為6次。綜合考慮轉(zhuǎn)化效率和結(jié)實(shí)效率轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌菌液最適濃度OD600為0.6、AS最適濃度為100μmol/L、蔗糖溶液最適濃度為20％、超聲波處理參數(shù)為處理功率為150w,處理時(shí)

3、間為5s/次，處理次數(shù)為6次。收獲的籽粒中兩粒呈紫色，經(jīng)過(guò)PCR、southern鑒定成陽(yáng)性，初步證實(shí)NtAN2已被整合到玉米基因組中，并且可以被用于對(duì)轉(zhuǎn)化子的直觀篩選。隨后對(duì)其T2代植株進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果也均成陽(yáng)性，證實(shí)外源基因可以穩(wěn)定的遺傳本研究確立了超聲波輔助花粉介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的最佳體系，為提高該植物基因轉(zhuǎn)化方法的效率奠定了基礎(chǔ)。
　　大蒜是一種現(xiàn)食藥兩用的植物，備受關(guān)注，它在植物、動(dòng)物、人類醫(yī)學(xué)界都有重要地位，尤其是它在植物中

4、的抑菌作用，本研究利用這一性質(zhì)探究它對(duì)玉米病菌的抑菌效果如何，并且有研究表明半胱氨酸合成酶的產(chǎn)物半胱氨酸是大蒜中含硫氨基酸豐富是植物中含硫氨基酸的重要來(lái)源，研究大蒜半胱氨酸合成酶的性質(zhì)及生物學(xué)功能以明確其在大蒜硫代謝中的作用。利用涂布打孔發(fā)法比較分析大蒜粗酶提取液、大蒜素、蒜氨酸酶對(duì)玉米的霉菌、絲黑穗菌、黑粉病菌的抑制情況。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的3個(gè)大蒜的半胱氨酸合成酶基因（ASGCS2、ASGCS3和ASGCS

5、4）的開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)其蛋白序列、分子量大小、蛋白質(zhì)特性、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化等特征;通過(guò)熒光定量PCR分析了3個(gè)半胱氨酸合成酶的組織表達(dá)特性。結(jié)果表明：大蒜素及粗酶提取液對(duì)玉米的三種病菌都以抑制作用。3個(gè)大蒜的半胱氨酸合成酶基因ASGCS2、ASGCS3和ASGCS4的開(kāi)放態(tài)讀碼框長(zhǎng)度分別為1152bp，1296bp和1236bp;其編碼蛋白的理論相對(duì)分子量分別為40.6KD，34.1KD和36.1KD。ASGCS2被亞細(xì)胞定位于葉綠

6、體中，而ASGCS3和ASGCS4均被定位于細(xì)胞質(zhì)中。氨基酸比對(duì)結(jié)果表明，ASGCS2與ASGCS3相似度為70％，與ASGCS4相似度為59％;而ASGCS3與ASGCS4相似度為68％。進(jìn)化分析表明，AsGCS2屬于Bsas2亞家族，AsGCS3屬于Bsas1亞家族，AsGCS4屬于Bsas6亞家族。熒光定量PCR結(jié)果表明，大蒜不同CSase的組織特異性是不同的，ASGCS2在葉中表達(dá)量最高，ASGCS3在根中表達(dá)量最高，而ASGC