蛋氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性對半胱氨酸水平及動脈粥樣硬化性腦梗塞的影響.pdf

1、目的： 高同型半胱氨酸(tHcy)血癥作為動脈粥樣硬化的獨立危險因子得到了廣泛的重視。研究同型半胱氨酸(Hcy)代謝過程中關(guān)鍵酶的基因多態(tài)性是否影響血漿半胱氨酸濃度進而是否與心腦血管病相關(guān)成為必要。本研究檢測動脈粥樣硬化性腦梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者與正常對照者的血漿半胱氨酸濃度及MTRRA66G基因多態(tài)性，探討蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G基因多態(tài)性對血漿半胱

2、氨酸濃度的影響，并研究其在中國華東地區(qū)漢族人群中的分布及其與動脈粥樣硬化性腦梗塞的關(guān)系。 方法： 1、實驗分組： 本實驗選取2004年9月-2005年6月間本院神經(jīng)內(nèi)科動脈粥樣硬化性腦梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者94例，定為： (A)動脈粥樣硬化性腦梗塞(ACI)組94例(男46例，女48例)，年齡43-80歲(59.0±10.5)歲。均符合全國第

3、四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭部CT及(或)MRI證實。不包括心律失常、動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的ACI；排除梗死后出血，肝、腎功能障礙的病例，以及自身免疫性疾病、妊娠、半年內(nèi)曾降脂治療者。 (B)正常對照組，選取2004年-2005年本院查體中心健康查體者145例(男75例，女70例)，年齡40-77歲(57.3±10.9)歲。均經(jīng)臨床檢查和(或)影像學(xué)檢查排除心、腦血管病，無腦血

4、管病家族史，排除肝、腎疾病、血液病、自身免疫性疾病、妊娠、半年內(nèi)曾有降脂治療者。兩組之間性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)無顯著性差異。所有入選者均為華東地區(qū)漢族，相互間無血緣關(guān)系。 2、血清生化指標(biāo)、血漿半胱氨酸濃度測定： 所有受試者取清晨空腹外周靜脈血5ml： 2ml靜止30分鐘后離心取血清，應(yīng)用OlympusU640自動生化分析儀測定血清膽固醇TCH、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL及血糖

5、TG； 3ml與1.5mg/mlEDTAK2按100∶1體積抗凝，立即2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取20ul血漿用于測定血漿中半胱氨酸濃度，剩余血樣置4℃冰箱中儲存，一周內(nèi)成批提取DNA。 所有觀察對象均于采血當(dāng)日收集病史。 3、MTRR基因A66G多態(tài)性檢測： 取20ul血漿后的血樣置4℃冰箱中儲存，一周內(nèi)成批提取DNA(應(yīng)用美國Promega公司出品的DNA純化試劑盒)，DNA提取液置-20℃冰箱中儲存

6、。 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)檢測樣本MTRR基因。引物設(shè)計參考文獻設(shè)計為： Primer1∶5'-CAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGACAT-3' Primer2∶5'-CACTTCCCAACCAACCAAAATTCTTCAAAG-3' 配制25μl反應(yīng)體系，基因組DNA200ng、引物20pmol、MgCl21.5mmol/L、dNTP200μol/

7、L、tag酶1U。 94℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，進行40個循環(huán)。最后1次循環(huán)后72℃延伸7min。 然后用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物，-20℃保存。 將擴增產(chǎn)物提純后，取22μl擴增產(chǎn)物，10×buffer3μl，H2O1.5μl，限制性內(nèi)切酶(NadeI)10U，37℃水浴消化過夜，以5.5％瓊脂糖電泳分析酶切產(chǎn)物，溴化乙錠染色，UVA凝膠成像系統(tǒng)檢測、攝片。

8、 由兩人分別判讀基因型，對于不確定者選出重做。判讀方法如結(jié)果所示，比較兩組基因型和等位基因頻率分布有無差異。 4、統(tǒng)計學(xué)處理： 全部數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗后，正態(tài)分布量以(x)±s表示，非正態(tài)分布變量以對數(shù)轉(zhuǎn)換近似正態(tài)分布。遺傳平衡吻合度檢驗用Hardy-Weinberg平衡法。數(shù)值型變量采用單因素方差分析，分類變量采用X2非參數(shù)檢驗。危險因素分析采用單因素Logistic回

9、歸。 結(jié)果： 1、血漿半胱氨酸水平： 血漿半胱氨酸水平在ACI組(18.9±12.7μmol/L)顯著高于正常對照組(7.3±3.3μmol/L)，p＜0.001。 2、MTRRA66G基因型 MTRR基因第66位單個堿基腺嘌呤(A)突變?yōu)轼B嘌呤(G)，表現(xiàn)為AA、AG、GG三種基因型。研究證實野生純合子(基因型AA)存在NadeI酶切位點，酶切后電泳有124、27、151bp，無酶切位點酶切后電

10、泳只有151bp片斷。 即AA：124、27bp，AG：124、151、27bp，GG：151bp。 3、基因型分布比較 MTRR基因A66G多態(tài)性在研究人群中的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(ACI組Df=1，x2=1.22，p＞0.05；對照組Df=1，x2=0.61，p＞0.05)，說明本研究組人群具有群體代表性，不存在選擇偏倚。AA、AG、GG基因型頻率在ACI組為12.8％、53.2％和3

11、4％，對照組分別為26.2％、53.1％和20.7％。組間基因型頻率差異有顯著性(x2=8.84，p=0.01)。 4、基因多態(tài)性與血漿Hcy水平的比較組內(nèi)比較GG基因型血漿半胱氨酸濃度均高于其他兩種基因型。 5、ACI形成危險因素分析： 以血漿Hcy濃度、MTRR基因型、TCH、Glu和HDL為自變量，ACI發(fā)生為因變量的Logistic多元回歸分析顯示，血漿Hcy濃度、TCH、Glu是危險因素；相關(guān)分析顯示，

12、血漿Hcy濃度與TCH、Glu均無相關(guān)性，表明Hcy濃度升高是ACI發(fā)生的獨立危險因素，OR=1.286。而MTRR基因型并非獨立危險因素。 結(jié)論： 1、同型半胱氨酸可通過刺激血管平滑肌細胞增生，破壞機體凝血和纖溶平衡，使內(nèi)皮損傷和功能異常等，使機體處于血栓前狀態(tài)，從而增加了心腦血管疾病發(fā)病的危險性。本實驗中血漿半胱氨酸水平在ACI組顯著高于正常對照組，證實高Hcy血癥與動脈粥樣硬化性腦梗塞有關(guān)，是ACI的獨立危險因素之

13、一。 2、MTRR催化無活性蛋氨酸合成酶轉(zhuǎn)換成有活性的酶，從而在蛋氨酸和葉酸循環(huán)中起重要作用。發(fā)生突變后蛋氨酸殘基被異亮氨酸替代，有可能影響酶的催化活性，導(dǎo)致半胱氨酸代謝受阻。本次結(jié)果中MTRRAA、AG基因型同型半胱氨酸水平與GG基因型同型半胱氨酸水平相比有明顯差異，說明MTRR基因型不同會影響Hcy在血漿中的濃度。 3、MTRR多態(tài)性位點等位基因頻率在不同種族中有差異性，本次研究首次揭示了華東地區(qū)漢族MTRR基因的等

14、位基因頻率(A等位基因47.45％、G等位基因52.45％)，兩組間等位基因頻率分布無顯著性(p＞0.05)。在本研究中MTRR基因A66G多態(tài)性在研究人群中的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡，MTRRAA、AG、GG基因型頻率在ACI組為12.8％、53.2％和34％，對照組分別為26.2％、53.1％和20.7％，AA、AG、GG基因型頻率在組間有差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。提示MTRR多態(tài)性可能與動脈粥樣硬化