α-硫辛酸經(jīng)PI3K-Akt和Nrf2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1.pdf

1、目的:
　　觀察α-硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）對(duì)外源性H2O2對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶（Heme oxygenase，HO）-1的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19，并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組：（1）空白對(duì)照組：僅給予等體積培養(yǎng)基；（2）H2O2干預(yù)組：ARPE-19細(xì)胞中加入終濃度為12.5mol/L H2O2作用30min

2、；（3）ALA干預(yù)組：H2O2作用后加入10～30μmol/L ALA作用4～24h；（4）PI3K抑制劑組：在組3基礎(chǔ)上加入25μmol/L LY294002作用30 min；（5）siRNA干預(yù)組：采用特異性siRNA干擾Nrf2或HO-1表達(dá)，隨后根部不同研究目的加入H2O2和（或）ALA；（6）CoPP或ZnPP干預(yù)組：在組3基礎(chǔ)上加入10μmol/L CoPP或ZnPP作用3h。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)H

3、O-1 mRNA和蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞凋亡；熒光探針檢測(cè)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生；Western blot檢測(cè)Akt磷酸化及Nrf核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平極低，12.5mol/L H2O2處理30min后，HO-1僅有輕微增高。不同濃度ALA孵育后，隨著ALA劑量的增加，HO-1表達(dá)逐漸增

4、多；
　　2. H2O2作用ARPE-19細(xì)胞30min后，磷酸化Akt水平僅輕微增加。10～30μmol/L ALA作用4h后，磷酸化Akt水平隨著ALA濃度的增高而增加；
　　3.陰性對(duì)照組ARPE-19細(xì)胞無(wú)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位。30μmol/L ALA作用后，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量顯著增高。而同時(shí)給予25μmol/L PI3K抑制劑LY294002處理后，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2明顯降低；
　　4.采用siRNA干擾Nrf

5、2表達(dá)后，與對(duì)照siRNA組相比，HO-1表達(dá)顯著降低。
　　5. H2O2處理可明顯誘導(dǎo) ARPE-19細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生 ROS。同時(shí)給予30μmol/L ALA處理后，細(xì)胞凋亡率和ROS分泌顯著降低。ALA干預(yù)的同時(shí)給予HO-1抑制劑ZnPP處理后，細(xì)胞凋亡率和ROS上升至H2O2組水平；siRNA干擾HO-1表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率、ROS水平與ZnPP處理組類似。而ALA聯(lián)合HO-1激動(dòng)劑CoPP處理，能進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡