辛伐他汀通過PI3K-AKT-miR-9通路促進BMSCs的歸巢.pdf

1、本研究分為三個部分。
　　第一部分 辛伐他汀促進BMSCs歸巢并提高其防治橋血管狹窄的功能
　　目的:研究辛伐他汀對BMSCs的CXCR4表達及體外、體內定向遷移能力的影響，探討辛伐他汀對干細胞移植防治橋血管狹窄功能的改善。
　　方法:1.用不同濃度的辛伐他汀(0、0.1、0.33、1μM)刺激BMSCs，48h后通過Westen blot檢測總蛋白中CXCR4表達量的變化;辛伐他汀刺激BMSCs48h后，通過流式細胞

2、術檢測細胞表面CXCR4表達變化情況。2.用Transwell小室檢測BMSCs在辛伐他汀(終濃度1μM)和/或AMD3100(一種抑制CXCR4趨化因子受體拮抗劑，終濃度5μg/mL)作用下向SDF-1α遷移。分為三組:對照組、辛伐他汀組、AMD3100+辛伐他汀組。通過與對照組比較研究辛伐他汀在體外對BMSCs歸巢能力的影響并確定該影響是通過調節(jié)CXCR4表達來實現的。
　　結果:Western blot表明，隨著辛伐他汀濃度

3、的增加，BMSCs內總CXCR4的表達逐漸增加，沒有辛伐他汀干預的情況下最低，辛伐他汀濃度最大時(1μ M)，表達量最高。流式細胞檢測發(fā)現，辛伐他汀能夠提高BMSCs表面CXCR4的陽性表達率，辛伐他汀組樣品細胞表面平均熒光強度強于對照組樣品細胞，中位熒光強度較對照組也有所增強。在SDF-1α趨化作用下，與正常培養(yǎng)BMSCs比，辛伐他汀刺激48h后的BMSCs遷移明顯增加。AMD3100阻斷CXCR4之后，辛伐他汀干預所引起的BMSCs

4、定向遷移增加受到抑制。細胞移植至動物模型內7天后，在橋血管內膜處可見大量CM-DiI標記的移植細胞。與單純細胞移植相比，應用辛伐他汀能明顯促進BMSCs向移植靜脈橋血管內膜處遷移，AMD3100可以抑制這一作用，降低了辛伐他汀對干細胞歸巢的促進作用。28天后，橋血管新生內膜HE染色發(fā)現，較單獨應用干細胞移植相比聯合應用辛伐他汀及干細胞移植能夠更有效的減少新生內膜的產生。應用AMD3100后，辛伐他汀對干細胞防治橋血管狹窄作用的改善被削弱

5、。
　　結論:在辛伐他汀作用下，BMSCs的CXCR4表達增加，尤其是細胞表面CXCR4表達增加，向SDF-1α趨化遷移能力增強，應用AMD3100可以抑制這一增強的趨勢，進一步說明辛伐他汀促進BMSCs定向遷移能力是通過促進CXCR4表達實現的。在動物模型中，辛伐他汀可以促進BMSCs在橋血管內膜的歸巢，進而更好的抑制了新生內膜的增生，最終證明辛伐他汀能改善BMSCs移植對橋血管狹窄的防治功能。
　　第二部分 PI3K/A

6、KT信號通路參與辛伐他汀引起的CXCR4過表達
　　目的:研究辛伐他汀促進BMSCs過表達CXCR4的過程中是否有PI3K/AKT通路的參與。
　　方法:1.用不同濃度(0、0.1、0.33、1μM)的辛伐他汀刺激BMSCs，48h后通過Westen blot檢測AKT及磷酸化AKT表達量的變化并與CXCR4表達量變化程度進行比較。2.PI3K/AKT通路抑制劑LY294002預處理間充質干細胞后，再行辛伐他汀干預，West

7、ern blot觀察CXCR4,AKT及磷酸化AKT三種蛋白的表達變化情況，分組:對照組，使用正常完全培養(yǎng)基，不添加LY294002及辛伐他汀;辛伐他汀組，培養(yǎng)基中添加辛伐他汀(終濃度1μM)，培養(yǎng)48小時;PI3K抑制劑+辛伐他汀組，培養(yǎng)基中先加入LY294002(終濃度30μM)培養(yǎng)2小時以阻斷AKT活化過程，然后加入辛伐他?。ńK濃度1μM），培養(yǎng)48小時;PI3K抑制劑組，培養(yǎng)基中加入LY294002（終濃度30μ M），培養(yǎng)48

8、小時。
　　結果:Western blot結果表明，隨著辛伐他汀濃度不斷增加，p-AKT表達量逐漸增加，對照組培養(yǎng)基中未加入辛伐他汀，細胞內p-AKT表達量最低，該信號通路活性最低，而當辛伐他汀濃度為1μM時，p-AKT表達量達到最大，該通路得到最大程度的激活。p-AKT表達上升趨勢與CXCR4表達上升趨勢相似，在對照組中，BMSCs未受到辛伐他汀的干預作用，兩者的表達量均為最低，隨辛伐他汀濃度增加，兩者表達量逐漸增加，在辛伐他汀

9、濃度為1μM時，兩者表達量最高，而AKT的表達無顯著變化。AKT的活化受到LY294002抑制之后，p-AKT表達下降，CXCR4表達也隨之下降。辛伐他汀對p-AKT的表達的促進作用也被抑制劑的預處理削弱，辛伐他汀對BMSCs內CXCR4過表達的促進作用也被抑制，兩者表達變化方向一致。應用抑制劑之前，辛伐他汀可以明顯的促進干細胞的定向遷移;應用抑制劑之后，該促進作用明顯降低。與對照組相比，單獨應用抑制劑并沒有明顯的減輕細胞的定向遷移，可

10、能跟BMSCs經過培養(yǎng)后，CXCR4陽性細胞明顯減少有關。
　　結論:在辛伐他汀作用下，BMSCs內PI3K/AKT信號通路激活，磷酸化AKT促進CXCR4的表達。抑制該通路可以抑制CXCR4表達的同時也能減弱辛伐他汀對CXCR4表達的促進作用，進而抑制了BMSCs的定向遷移能力。PI3K/AKT通路參與辛伐他汀促進CXCR4表達的過程.
　　第三部分 miR-9參與辛伐他汀引起的CXCR4過表達，其表達也受PI3K/AKT

11、/通路調控
　　目的:研究辛伐他汀干擾BMSCs后，與CXCR4相關程度高的miRNAs表達的變化，并驗證其是否以CXCR4為靶基因。同時研究其表達與PI3K/AKT通路活性的關系。
　　方法:1.根據TargetScan5.2,PicTar，及miRanda的預測，找出可能以CXCR4為靶基因的miRNA（預測結果顯示具有較好評分），并以這些miRNA為目標進行研究。通過RT-qPCR檢測辛伐他汀作用下這些miRNA表達的

12、變化，根據變化水平，篩選出可能相關的miRNA。2.根據篩查的miRNA表達情況我們發(fā)現miR-9表達下降最明顯，因此，實驗中選miR-9作為研究目標。1）瞬時轉染miR-9的模擬物及抑制物后觀察間充質干細胞CXCR4表達的變化:a）Westernblot檢測總蛋白中CXCR4含量，分組為模擬物組（瞬時轉染模擬物Mimics片段）、陰性對照組（瞬時轉染陰性對照Negative Control片段）、抑制物組（瞬時轉染抑制物Inhibit

13、or片段）、抑制物陰性對照組（瞬時轉染抑制物陰性對照Inhibitor N.C.片段）;b）流式細胞術檢測BMSCs表面CXCR4表達，包括陽性率、平均熒光強度、中位熒光強度，分組為對照組、模擬物組、抑制物組，各分組處理同上。2）Transwell實驗檢測瞬時轉染miR-9的抑制物對BMSCs向SDF-1α定向遷移能力的影響。分組為對照組（不轉染）和抑制物組（瞬時轉染抑制物Inhibitor片段）。3）將含有miR-9靶序列（野生型）及

14、突變序列（突變型）的報告基因質粒與miR-9模擬物/陰性對照片段共轉染進BMSCs。檢測細胞內熒光素酶表達情況以驗證CXCR4是否為miR-9的靶基因。分組:a）野生型質粒轉染組，僅轉染野生型質粒，b）野生型質粒+模擬物轉染組，共轉染野生型質粒以及模擬物，c）野生型質粒+陰性對照轉染組，共轉染野生型質粒以及陰性對照片段，d）突變型質粒轉染組，僅轉染突變型質粒，e）突變型質粒+模擬物轉染組，共轉染突變型質粒以及模擬物，f）突變型質粒+陰性

15、對照轉染組，共轉染突變型質粒以及陰性對照片段。
　　結果:根據TargetScan5.2,PicTar，及miRanda的預測，我們對辛伐他汀刺激后，BMSCs內40種miRNA表達量進行了分析，其中miR-21、miR-369-3p、miR-132和miR-9表達下降，以miR-9下降最為明顯。瞬轉后，miR-9的模擬物使BMSCs對CXCR4的表達下降，而其抑制物可以促進CXCR4的表達。流式細胞儀檢測表明，miR-9模擬物能

16、夠抑制BMSCs表面CXCR4表達，其陽性率降低，平均熒光強度、中位熒光強度也降低，miR-9抑制物可以促進BMSCs表面CXCR4的表達，包括陽性率、平均熒光強度、中位熒光強度較對照組均有所增強。Transwell實驗表明，BMSCs向SDF-1α的遷移也被該抑制物增強。雙熒光素酶報告基因系統進一步驗證了CXCR4為miR-9的靶基因，miR-9可明顯抑制轉染野生型報告質粒的細胞螢火蟲熒光素酶表達，卻不能明顯抑制轉染突變型報告質粒的細

17、胞螢火蟲熒光素酶表達。隨著辛伐他汀濃度的增加，miR-9表達水平逐漸下降，對照組培養(yǎng)基中未加入無辛伐他汀，細胞內miR-9表達量最高，而當辛伐他汀濃度為1μM時，miR-9表達量達到最低，與磷酸化AKT的表達趨勢相反;而通過LY294002抑制PI3K/AKT通路后，較對照組相比，miR-9表達顯著增加。
　　結論:CXCR4是miR-9的靶基因，miR-9的模擬物可以直接抑制BMSCs對CXCR4的表達，抑制miR-9的表達可以