胰島素受體底物1通過(guò)PI3K-Akt通路下調(diào)大鼠成骨細(xì)胞NFκB和BAX表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖.pdf

1、目的:糖尿病影響骨代謝，誘發(fā)糖尿病性骨病。胰島素受體底物1(insulinreceptor substrate1，IRS1)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中受體后水平的重要信號(hào)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)IRS1不僅促進(jìn)骨形成，而且影響骨吸收，IRS1主要作用于成骨細(xì)胞影響骨轉(zhuǎn)換，但機(jī)制尚不完全清楚。抑制成骨細(xì)胞NFκ B(nuclear factor kappa-B，NFκB)通路增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化、礦化和骨形成，但直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞NFκB的基因仍需確定。高糖

2、環(huán)境導(dǎo)致凋亡蛋白BAX(Bcl2-associated X protein，BAX)表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)IRS1具有抗凋亡能力，但I(xiàn)RS1如何調(diào)控成骨細(xì)胞BAX尚不清楚。
　　糖尿病影響骨代謝，誘發(fā)糖尿病性骨病。1型糖尿病病人骨密度降低，2型糖尿病病人骨密度正常、升高或降低。試驗(yàn)證據(jù)清楚表明無(wú)論1型還是2型糖尿病病人骨折風(fēng)險(xiǎn)性均增加。糖尿病病人骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加與成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收不平衡相關(guān)。多種機(jī)制參與糖尿病性骨病的發(fā)生。

3、胰島素和IGF1信號(hào)通路在糖尿病發(fā)揮重要作用，且與骨代謝密切相關(guān)。研究報(bào)導(dǎo)糖尿病病人骨量和胰島素劑量、尿C肽呈正相關(guān)，外源性和內(nèi)源性胰島素可能影響糖尿病病人骨代謝平衡。胰島素和IGF1通過(guò)經(jīng)典細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響骨代謝，下游IRS1/2、Akt(Protein Kinase B，Akt)和MEK(MAPK/ERK kinase，MEK)作用機(jī)制尚不清楚。除經(jīng)典途徑外，胰島素和IGF1可能通過(guò)成骨細(xì)胞Wnt(wingless-int)和

4、BMP2(bonemorphogenic protein2)通路促進(jìn)骨骼發(fā)育。胰島素直接影響成骨細(xì)胞代謝。體外研究發(fā)現(xiàn)生理劑量胰島素促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、膠原合成、堿性磷酸酶產(chǎn)生，目前仍不完全清楚胰島素促進(jìn)骨形成機(jī)制。胰島素促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)育和骨鈣素表達(dá)，骨鈣素參與骨礦化和鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡。IGF1通過(guò)自分泌和旁分泌方式促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)骨形成。青春期時(shí)期，IGF1決定長(zhǎng)骨生長(zhǎng)、骨骼發(fā)育和骨量增加，成年階段維持

5、骨量。IGF1增加成骨細(xì)胞數(shù)目和活性以增加骨形成;抑制破骨細(xì)胞分化以減少骨吸收。
　　IRS1是胰島素和IGF1信號(hào)通路重要靶分子，且對(duì)維持正常骨代謝有重要意義。IRS1基因敲除小鼠骨形成和骨吸收均減少。IRS1基因自發(fā)性突變影響成年后骨骼表型，表現(xiàn)為高胰島素血癥及低骨密度等。IRS1基因敲除小鼠骨折難愈合提示IRS1參與骨修復(fù)，而且其作用不能被IRS其他亞型和IGF通路替代。IRS1缺陷小鼠骨愈合受損，這種受損在IRS1重新表達(dá)

6、后恢復(fù)。IRS1主要經(jīng)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換，其中機(jī)制仍不完全清楚。大量體外研究已證明IGF1和IRS/PI3K/Akt通路促進(jìn)成骨細(xì)胞骨分化。抑制IRS1減少成骨細(xì)胞壽命、增殖、礦化和分化。IRS1通過(guò)促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖和分化增加骨形成，產(chǎn)生更多膠原增加骨基質(zhì);IRS1不僅促進(jìn)骨形成和礦化，也經(jīng)由MMPs(matrix metallopeptidases，MMPs)和RANKL/TNFRSF11B(tumor necrosis facto

7、r receptor superfamily, member11b)比率影響骨吸收，最終調(diào)節(jié)骨循環(huán)。此外，予以IRS1干擾RNA抑制RUNX2(runt-relatedtranscriptionfactor2,RUNX2)、ALP(alkalinephosphatase, ALP)和BSP(bone sialoprotein, BSP)表達(dá)。
　　PI3K/Akt通路與骨代謝關(guān)系密切。越來(lái)越多證據(jù)表明許多信號(hào)分子在骨發(fā)揮其特異性效

8、應(yīng)通過(guò)選擇性激活成骨細(xì)胞PI3K/Akt通路。此外PI3K/Akt可以與其他信號(hào)通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控骨細(xì)胞發(fā)育，也有證據(jù)表明PI3K/Akt信號(hào)通路失控可能與某些骨骼病變相關(guān)。激活PI3K/Akt通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活PI3K/Akt通路抑制成骨分化。破骨細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子SIP(Sphingosine-1-Phosphate,S1P)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物包括堿性磷酸酶表達(dá)上調(diào)，

9、并促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移。破骨細(xì)胞分泌骨吸收介質(zhì)通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化和鈣化。HGF(Hepatocyte growthfactor，HGF)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增加骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)表達(dá)調(diào)控骨礦化。在成骨細(xì)胞和鈣化血管平滑肌細(xì)胞，Xie H等發(fā)現(xiàn)omentin1激活PI3K/Akt信號(hào)通路激活OPG和抑制RANKL產(chǎn)生，減輕OPG-/-小鼠動(dòng)脈鈣化和骨質(zhì)流失。Akt磷酸化抑制糖

10、皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。胰島素依賴型糖尿病通過(guò)抑制Akt，減弱骨形成。激活A(yù)kt，增加破骨細(xì)胞形成和增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化。Akt蛋白家族有3個(gè)亞型:Akt1，Akt2和Akt3。Akt1和Akt2均在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞大量表達(dá)，除了Akt3。雖然Akt蛋白單亞型敲除小鼠表現(xiàn)出溫和的表型，但是Akt1和Akt2都敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重骨骼發(fā)育受損和侏儒癥。Akt1促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和存活，Akt1缺陷抑制成骨細(xì)胞RANKL表達(dá)，引起破骨

11、細(xì)胞自主功能障礙，損害骨吸收功能。Akt1和Akt2都敲除下調(diào)RANKL誘導(dǎo)的NFκB p50的DNA結(jié)合能力，抑制破骨細(xì)胞分化。
　　NFκB與骨代謝密切相關(guān)。由RANKL（nuclear factor kB ligand，RANKL）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）或者白介素1（interleukin1，IL1）激活的NFκB信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)破骨分化基因表達(dá)，延長(zhǎng)破骨細(xì)胞壽命，增加骨吸收。成

12、骨細(xì)胞NFκB活性降低時(shí)，JNK活性增強(qiáng)，導(dǎo)致骨形成增強(qiáng)。抑制NFκB通路可以逆轉(zhuǎn)TNFα抑制的成骨細(xì)胞分化。Julien M等發(fā)現(xiàn)在成熟成骨細(xì)胞NFκB通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制成骨細(xì)胞礦化。體外抑制成骨細(xì)胞NFκB信號(hào)通路，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞礦化，但是破骨細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有改變。NFκB激活導(dǎo)致成骨細(xì)胞釋放IL6，成骨細(xì)胞釋放IL6導(dǎo)致破骨細(xì)胞激活。但直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞NFκB的基因仍需確定。
　　研究發(fā)現(xiàn)凋亡可能是骨質(zhì)疏松癥第三大常見(jiàn)原因，

13、估計(jì)60～80％成骨細(xì)胞正處于凋亡。成骨細(xì)胞凋亡增加松質(zhì)骨生成。Bcl2(B-cell lymphoma2，Bcl2)家族長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是凋亡主要調(diào)節(jié)機(jī)制，其中Bcl2抑制凋亡，BAX促進(jìn)凋亡，二者獨(dú)立調(diào)節(jié)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠凋亡顯著增加。糖尿病時(shí)，高糖環(huán)境引起細(xì)胞損傷，BAX激活和引起其他促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C釋放。1型糖尿病小鼠骨中成骨細(xì)胞凋亡增加。一些研究表明IRS1具有抗凋亡能力，IRS1可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2調(diào)控凋亡。

14、　　本研究組前期試驗(yàn)顯示2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病可能與骨組織IGF1、IRS1、IRS2表達(dá)受抑制有關(guān)，同時(shí)可能與骨組織PI3K、Akt表達(dá)降低、NFκB表達(dá)升高有關(guān)。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建pEGFP-N1-IRS1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，同時(shí)給予PI3K激酶特異性抑制劑LY294002，觀察在有或無(wú)LY294002條件下成骨細(xì)胞NFκB、BAX表達(dá)變化及成骨細(xì)胞細(xì)胞周期變化，為闡明糖尿病骨病的發(fā)生機(jī)制提供一條新

15、思路。
　　方法:
　　第一部分:提取Wister大鼠肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。根據(jù)NCBI提供的IRS1基因編碼序列，委托DNA合成公司合成帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物，以cDNA作為模板合成IRS1，插入pEGFP-N1質(zhì)粒，獲得過(guò)表達(dá)IRS1的表達(dá)載體。體外轉(zhuǎn)染人Hela細(xì)胞。
　　第二部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài)，傳代至第二代時(shí)茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。傳代

16、至第二代時(shí)pEGFP-N1-IRS1表達(dá)載體脂質(zhì)體法LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用PI3K激酶特異性抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt通路，免疫熒光和Western blotting法觀察成骨細(xì)胞NFκB表達(dá)變化。
　　第三部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細(xì)胞，傳代至第二代時(shí)pEGFP-N1-IRS1脂質(zhì)體法LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)

17、用LY294002阻斷PI3K/Akt通路，觀察成骨細(xì)胞IRS1/PI3K/Akt通路及BAX的表達(dá)變化。同時(shí)檢測(cè)成骨細(xì)胞細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:
　　第一部分:構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切分析、PCR分析初步判斷重組質(zhì)粒中所插入的片段與預(yù)期長(zhǎng)度一致。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，合成的IRS1序列與登錄在GenBank上的大鼠IRS1基因序列(GenBank登錄號(hào):NM_012969.1)高度同源，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)堿基與已發(fā)表的IRS1序列不同

18、:NM_012969.1的第414、1824、2631位堿基分別是C、C和A，而合成的IRS1片段這3個(gè)堿基突變?yōu)門、T和G，但合成的IRS1序列翻譯的蛋白質(zhì)和NM_012969.1翻譯的蛋白質(zhì)一致。熒光顯微鏡下IRS1-GFP融合蛋白在Hela細(xì)胞成功表達(dá)。
　　第二部分:酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細(xì)胞，經(jīng)HE染色和茜素紅染色證明成骨細(xì)胞培養(yǎng)成功。熒光顯微鏡下IRS1-GFP融合蛋白在成骨細(xì)胞成功表達(dá);RT-

19、PCR結(jié)果表明IRS1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組IRS1 mRNA表達(dá)水平明顯增高;Western blotting結(jié)果顯示IRS1組pAktThr308蛋白水平相對(duì)對(duì)照組顯著增加，LY294002阻斷這種作用。免疫熒光和Western Blotting結(jié)果均表明IRS1組NFκB p65蛋白水平相對(duì)對(duì)照組降低，IRS1+LY294002組NFκB p65蛋白表達(dá)水平相對(duì)IRS1組增加。
　　第三部分:Western Blotting結(jié)果表明

20、IRS1組BAX蛋白水平相對(duì)對(duì)照組顯著降低，IRS1+LY294002組BAX蛋白表達(dá)水平相對(duì)IRS1組增加。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明IRS1組S期增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖;IRS1+LY294002組S期降低。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pEGFP-N1-IRS1表達(dá)載體，IRS1-GFP融合蛋白在體外成功表達(dá)。
　　2.pEGFP-N1-IRS1成功激活成骨細(xì)胞PI3K/Akt通路，抑制NFκBp65蛋白表達(dá)，PI3K抑制