脂聯(lián)素調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OPG-RANKL的表達(dá)和TIMP-3誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡.pdf

1、第一部分脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的影響及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。 第一章脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的影響。 目的：脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細(xì)胞的特異性分泌因子，成骨細(xì)胞可表達(dá)脂聯(lián)素受體，但脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚未闡明。本研究首次探討脂聯(lián)素對(duì)人成骨細(xì)胞護(hù)骨素(osteopotegrin,OPG)和核因子κB受體活化素配體(receptor activator of NF-kapp

2、aB ligand，RANKL)表達(dá)的作用。 方法：RT-PCR 及western印跡檢測體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞的脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor,AdipoR)mRNA 及 AdipoR蛋白表達(dá)。分別用0、3μg/ml、10μg/ml和30μg/ml脂聯(lián)素干預(yù)人成骨細(xì)胞48 h，或分別用0、30μg/ml脂聯(lián)素干預(yù)人成骨細(xì)胞0h、12h、24h和48h，干預(yù)前后OPG、RANKL的mRNA及蛋白表達(dá)分別用Re

3、al-time PCR和ELISA檢測。 結(jié)果：(1)人成骨細(xì)胞可表達(dá)AdiopR1 mRNA、AdiopR1蛋白和AdiopR2 mRNA；(2)脂聯(lián)素呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制人成骨細(xì)胞OPG的mRNA及蛋白表達(dá)；(3)脂聯(lián)素呈劑量和時(shí)間依賴性地促進(jìn)人成骨細(xì)胞RANKL的mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論：脂聯(lián)素可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)，是骨代謝的調(diào)節(jié)因子之一。 第二章脂聯(lián)素對(duì)人成骨細(xì)胞OPG和RANKL

4、表達(dá)影響的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 目的：研究脂聯(lián)素對(duì)人成骨細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：用小分子RNA干擾技術(shù)(siRNA)抑制AdiopR1表達(dá)，用30μg/ml 脂聯(lián)素單獨(dú)干預(yù)人成骨細(xì)胞48h，或絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑SB203580(p38MAPK阻斷劑)或SP600125(c-Jun氨基端激酶，JNK阻斷劑

5、)在脂聯(lián)素干預(yù)前2h加入，以觀察脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞OPG和RANKL作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。OPG和RANKL mRNA的表達(dá)用Real-time PCR檢測，MAPK中JNK、p38、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1/2用western印跡檢測。 結(jié)果：脂聯(lián)素通過AdipoR1激活p38MAPK；用AdipoR1-siRNA沉默AdipoR1的表達(dá)可阻斷脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞RANKL和OPG的作用；預(yù)先

6、給予MAPK阻斷劑SB203580阻斷p38后，脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞RANKL和OPG的作用亦被阻斷。 結(jié)論：在成骨細(xì)胞中，脂聯(lián)素通過AdipoRl/p38途徑促進(jìn)RANKL的分泌，并抑制OPG的表達(dá)。 第二部分重組組織金屬蛋白酶抑制因子-3蛋白誘導(dǎo)鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡。 目的：研究重組組織金屬蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3)蛋

7、白對(duì)鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡的影響及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法：用100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、600 μg/L TIMP-3 單獨(dú)干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，以觀察TIMP-3對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響；600 μg/L TIMP-3聯(lián)合MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑SP600125(JNK阻斷劑)、SB203580(p38阻斷劑)或PD098059(ERK1/2阻斷劑)干預(yù)MC3T3-E<,1>，以觀

8、察TIMP-3作用于MC3T3-E<,1>的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細(xì)胞存活率和凋亡用MTT及ELISA檢測，凋亡相關(guān)基因Fas、 Fasl、Bc1-2、Bax、caspase-3、caspase-8、cytochrome c的表達(dá)，以及絲裂原活化蛋白激酶JNK、p38、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1/2用Western印跡檢測。 結(jié)果：MTT及ELISA檢測提示，TIMP-3呈劑量依賴性抑制MC3T3

9、-E1細(xì)胞存活，呈劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。TIMP-1促進(jìn)Fas、Fasl蛋白質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)cytochrome c的釋放及caspase-8、caspase-3的活化，而對(duì)Bax、Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)無影響。TIMP-3促進(jìn)p38和ERK 1/2磷酸化，而PD098059(ERK1/2阻斷劑)和SB203580(p38阻斷劑)消除p38和ERK 1/2介導(dǎo)的促凋亡作用。 結(jié)論：TIMP-3通過死亡受體Fa