染氟大鼠肝臟、成骨組織及大鼠原代成骨細(xì)胞中LC3A、Becin-1、Bcl-2、Bax的表達(dá)及對(duì)成骨細(xì)胞損傷機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究慢性氟中毒大鼠肝臟組織、成骨組織及染氟大鼠原代成骨細(xì)胞中自噬相關(guān)因子 LC3A、Beclin-1及凋亡因子 Bcl-2、Bax的蛋白及其mRNA的表達(dá)水平；探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methy ladenine,3-MA））與自噬、凋亡的相互關(guān)系，以及氟中毒損傷成骨細(xì)胞機(jī)制。
　　方法:
　　1.將36只健康SD大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、低氟組、高氟組，分別用含氟量＜1mg/L的自來(lái)水和含

2、氟5、50mg/L的含氟水飼養(yǎng)6個(gè)月，觀察氟斑牙形成情況；測(cè)定尿氟、骨氟含量以及大鼠肝功能；蘇木素-伊紅染色觀察肝臟病理學(xué)改變；免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry,IHC）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）法檢測(cè)大鼠肝臟組織、成骨組織中微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule associated protein light chain3A，LC3A）、哺乳動(dòng)物ATG6同源蛋白（a mammal

3、ian homolog ofyeast Atg6/Vps30，Beclin-1）及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell leukemia/lymphoma2，Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤/白細(xì)胞基因伴隨蛋白x（Bcl-2 associated x protein，Bax）的蛋白表達(dá)水平。2.原代培養(yǎng)SD乳鼠顱骨中的成骨細(xì)胞（Osteoblast，OB），采用CCK-8法分別檢測(cè)氟化鈉、3-MA的適合濃度以及時(shí)間段，原代細(xì)胞傳至第三代

4、后分成6組：對(duì)照組：含氟量為0mg/L、實(shí)驗(yàn)組：染氟（氟化鈉 NaF）分別為2.5（低氟組）、5（高氟組）mg/L，對(duì)照+3-MA組、低氟+3-MA組、高氟+3-MA組。WB和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)LC3A、Beclin-1、Bcl-2、Bax的蛋白及mRNA的表達(dá)水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組尿氟和骨氟[（1.92±0.12）mg/L、（185.57±13

5、.27）mg/Kg]比較，低、高氟組大鼠尿氟含量分別為[（2.18±0,14） mg/L、（2.40±0.19）mg/L]、骨氟含量[分別為（237.42±18.48）mg/Kg、（248.00±14.72）mg/Kg]均明顯升高（P＜0.05）。染氟組大鼠肝臟肝細(xì)胞索排列稍有紊亂，肝細(xì)胞水腫，病理形態(tài)學(xué)改變不明顯。與對(duì)照組比較，染氟組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase ALS）活性及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspart

6、ate aminotransferase AST)活性明顯升高，總蛋白（TP）與白蛋白（ALB）活性逐漸下降（P<0.05）。免疫組化示：低、高氟組大鼠肝臟組織中LC3A蛋白[（35.35±2.71）、（44.10±6.72）]、Beclin-1蛋白[（57.56±12.1）、（74.76±18.67）]及Bax[（51.1±9.23）、（62.32±10.3）]的表達(dá)明顯高于對(duì)照組[（27.55±2.33）、（40.34±6

7、.89）（40.00±8.03）]，Bcl-2蛋白表達(dá)分別為[（55.18±8.36）、（39.05±6.91）]明顯低于對(duì)照組(79.71±10.92)（P<0.05）；低、高氟組大鼠成骨組織中LC3A蛋白[（38.42±3.05）、（50.72±4.73）]、Beclin-1蛋白[（60.64±9.32）、（80.19±11.78）]、Bax蛋白[（51.26±11.05）、（64.93±12.74）]的表達(dá)明顯高于對(duì)照組[（25.

8、79±2.57）、（38.52±7.23）、（36.94±9.48）]，染氟組中Bcl-2蛋白表達(dá)分別為[（62.67±9.63）、（47.73±7.43）]明顯低于對(duì)照組(83.54±11.43)（P<0.05）。WB實(shí)驗(yàn)顯示：低、高氟組大鼠肝臟組織中LC3A蛋白[（1.311±0.123），(1.633±0.100)]、Beclin-1蛋白[（1.278±0.158）、（1.691±0.283）]、Bax蛋白[（0.473±0.07

9、5）、（0.678±0.048）]的表達(dá)分別高于對(duì)照組[（0.961±0.110）、（0.579±0.104）、（0.288±0.021）]；低、高氟組Bcl-2蛋白[（0.826±0.117）、（0.599±0.013）]的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（1.188±0.156）（P<0.05）。2.培養(yǎng)24h的染氟組（0、2.5、5、10mg/L）細(xì)胞增殖率分別為（100%、131.38%、151.82%、115.80%），48h的增殖率分別為

10、（100%、115.87%、83.31%、79.06%），72h的增殖率分別為（100%、80.91%、81.22%、66.66%）。染氟組處理24h后,分別用自噬特異性抑制劑3-MA（濃度2.5、5、10mmol/L）處理24h后，10mmol/L的3-MA對(duì)細(xì)胞的抑制率為52.1%。Beclin-1、LC3A、Bcl-2、Bax的蛋白及mRNA在對(duì)照組、對(duì)照+3-MA兩組之間的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。WB實(shí)驗(yàn)顯示：大

11、鼠成骨細(xì)胞中低、高氟組大鼠成骨細(xì)胞中 LC3A蛋白[（1.271±0.254）、（1.680±0.158）]、Beclin-1蛋白[（1.245±0.240）、（1.561±0.443）]、Bax蛋白[（1.252±0.060）、（1.001±0.190）]的表達(dá)明顯高于對(duì)照組LC3A蛋白（0.726±0.152）、Beclin-1蛋白（0.668±0.122）、Bax蛋白（0.879±0.890）；Bcl-2蛋白[（0.616±0.0

12、8）、（0.894±0.153）]表達(dá)較對(duì)照組（1.276±0.670）明顯下降。3-MA處理染氟細(xì)胞后，LC3A蛋白[（0.655±0.023）、（1.006±0.100）]、Beclin-1蛋白[（0.789±0.168）、（1.187±0.201）]、Bcl-2蛋白[（0.434±0.047）、（0.581±0.056）]的表達(dá)與同濃度染氟組相比明顯下降；而Bax蛋白[（1.546± 0.057）、（1.289±0.08

13、8）]的表達(dá)水平與同濃度染氟組相比升高，以低氟+3-MA組升高最明顯（P<0.05）。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：低、高氟組成骨細(xì)胞中LC3AmRNA[（2.381±0.205）、（3.154±0.384）]、Beclin-1 mRNA[（0.978±0.104）、（1.129±0.156）]、Bax mRNA[（2.348±0.254）、（1.508±0.147）]的表達(dá)水平較對(duì)照組 LC3AmRNA（1.562±0.148

14、）、Beclin-1 mRNA（0.697±0.057）、Bax mRNA（1.248±0.136）明顯升高，3-MA處理染氟成骨細(xì)胞后LC3A mRNA[（1.473±0.129）、（1.936±0.204）]、Beclin-1 mRNA[（0.508±0.054）、（0.903±0.106）]、Bcl-2 mRNA[（0.202±0.032）、（0.378±0.040）]的表達(dá)水平較相同濃度染氟組降低，染氟成骨細(xì)胞經(jīng)3-MA處理后B

15、ax mRNA[（3.872±0.367）、（2.408±0.289）]的表達(dá)水平較同濃度染氟組升高，以低氟+3-MA組升高最明顯（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示：對(duì)照組（16.85%）和對(duì)照+3-MA（17.14%）凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低氟組（25.04%）、高氟組（21.28%）較對(duì)照組凋亡率升高（P<0.05），3-MA處理染氟成骨細(xì)胞后凋亡率增高，低氟+3-MA組（42.05%）增加最明顯，高氟+3-MA組