2014年1月-2016年3月豬偽狂犬病病毒的分離鑒定.pdf

1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種能夠引起多種家畜及野生動(dòng)物罹患偽狂犬病的病毒，可以通過(guò)接種疫苗對(duì)該病毒的感染進(jìn)行積極的防御，但是2011年末新出現(xiàn)的PRV變異毒株使得偽狂犬病突然變?yōu)楦叨攘餍袪顟B(tài)，為了解PRV變異毒株在我國(guó)不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)中的流行情況，本研究對(duì)2014年1月-2016年3月來(lái)源于我國(guó)15個(gè)省份67家規(guī)?；i場(chǎng)的201份臨床樣品進(jìn)行了PRV的分離與鑒定，并對(duì)所分離的毒株進(jìn)行了gB、gC和

2、gE基因的序列分析、基因組限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析及抗原差異性分析等研究，從而為掌握 PRV在我國(guó)的流行情況及其分子生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.PRV的分離與鑒定
　　自2014年1月至2016年3月，本研究從湖北、河南、山東、安徽、江西、上海、浙江、江蘇、北京、內(nèi)蒙、廣西、四川、甘肅、湖南、廣東15個(gè)省份67家規(guī)?；i場(chǎng)的201份臨床樣品中分離到了29株P(guān)RV，并對(duì)其進(jìn)行了PCR鑒定、細(xì)胞病

3、變觀察、空斑純化（3輪）及穩(wěn)定傳代。
　　2.病毒分離株gB、gC及gE基因的測(cè)序與分析
　　針對(duì)所分離PRV毒株的主要毒力基因gB、gC及gE進(jìn)行測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明，所分離的29株P(guān)RV毒株之間具有較高的同源性，其gB、gC及gE基因的核苷酸序列最大差異分別為0.17％、0.19％和0.41％，氨基酸序列最大差異分別為0.77％、0.66％和0.99％。另外，這29株P(guān)RV與參考毒株之間gB、gC及gE基因核苷酸序列

4、最大差異分別為1.82％、2.87％和2.85％，氨基酸序列最大差異分別為5.11％、7.48％和4.53％。
　　氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，與Bartha-K61毒株等國(guó)外經(jīng)典毒株和鄂A毒株(Ea毒株)等國(guó)內(nèi)2010年之前流行的部分毒株相比這29株P(guān)RV分離株的gB、gC及gE基因氨基酸序列均存在特征性的插入、缺失及替換等特征性的變異。
　　gB、gC及gE基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，所分離病毒中有26株P(guān)RV在這三個(gè)基因上均

5、處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的遺傳進(jìn)化分支，與已經(jīng)報(bào)道的PRV-HeN1毒株等PRV變異毒株（An et al2013）屬于同一亞群，與Ea毒株等國(guó)內(nèi)2010年之前流行的毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；有趣的是，另外3株P(guān)RV表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)：其中2株P(guān)RV的gC基因與PRV-HeN1變異毒株位于同一分支，gE基因位于其他遺傳進(jìn)化分支；另外1株P(guān)RV的gE基因與PRV-HeN1變異毒株位于同一分支，gC基因位于其他遺傳進(jìn)化分支，但是這3株P(guān)RV與Ea毒株等國(guó)內(nèi)2

6、010年之前流行的毒株親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。這說(shuō)明了本研究所分離毒株主要為 PRV變異毒株，并且與雙城毒株（SC毒株）、Ea毒株等經(jīng)典毒株有著共同的進(jìn)化來(lái)源，均來(lái)自中國(guó)早期流行的毒株。
　　3.病毒分離株的基因組限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析
　　用限制性內(nèi)切酶BamH I對(duì)本研究所分離PRV、Ea毒株和Bartha-K61毒株進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果表明本研究所分離的PRV毒株與Ea毒株及Bartha-K61毒株均具有較大的

7、差異，并且本研究所分離的PRV毒株間表現(xiàn)出4種不同的酶切形態(tài)。
　　4.病毒分離株的抗原差異性分析
　　用Ea毒株、Bartha-K61毒株及CH/SMX/2012毒株（本實(shí)驗(yàn)室2012年分離的PRV變異毒株）制備的高免血清分別對(duì) Ea毒株、Bartha-K61毒株、CH/SMX/2012毒株及本研究所分離的部分PRV毒株進(jìn)行病毒交叉中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Bartha-K61毒株及Ea毒株高免血清對(duì)自身的中和效價(jià)均較高，分別達(dá)到

8、217.40和624.34，對(duì)本研究所分離 PRV的中和效價(jià)均較低，分別為90.19±43.05和242.36±69.58；CH/SMX/2012毒株高免血清對(duì)自身、Ea毒株、Bartha-K61毒株及本研究所分離PRV的中和效價(jià)均較高，分別為547.64、603.72、654.52和577.59±54.72，表明本研究所分離的PRV毒株與Bartha-K61毒株、Ea毒株等經(jīng)典毒株相比某些抗原發(fā)生了明顯改變，但是與CH/SMX/201