難治性癲癎患者致癎灶細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及機(jī)制的研究.pdf

1、癲癎是當(dāng)今世界上的一種嚴(yán)重腦部疾病，中國(guó)癲癎患病率為7‰，全國(guó)有癲癎病人800多萬(wàn)，且以每年27萬(wàn)的速率增長(zhǎng)。它是一種慢性腦部疾患，具有突發(fā)性和反復(fù)性的特點(diǎn)，以腦部神經(jīng)元過(guò)度放電引起突然反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。目前其發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展過(guò)程仍有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)，癲癎研究領(lǐng)域的細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)受到越來(lái)越多的關(guān)注。普遍認(rèn)為神經(jīng)元凋亡在癲癎的發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。對(duì)難治性癲癎患者手術(shù)切除致癎灶腦組織標(biāo)本的研究將有助于探索癲

2、癎的發(fā)病機(jī)制，從而為臨床新療法提供理論依據(jù)。 目的:細(xì)胞凋亡主要是指在一定的生理或者病理刺激下遵循自身程序發(fā)生的細(xì)胞死亡，由于凋亡是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)特殊基因程序而發(fā)生的，故又稱之為程序性死亡(PCD)。本研究通過(guò)觀察難治性癲癎患者手術(shù)切除癲癎灶中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，探討神經(jīng)元凋亡在癲癎發(fā)病機(jī)制中的意義。線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，生命體內(nèi)90％以上ATP是由線粒體產(chǎn)生。在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑中，線粒體起著中心調(diào)控作用，在某種意義上線粒體

3、可以決定細(xì)胞生存與死亡。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)線粒體途徑進(jìn)行研究，探討內(nèi)源性凋亡途徑在癲癎發(fā)生和發(fā)展中的作用，為臨床預(yù)防和治療癲癎提供思路與依據(jù)。 方法:收集經(jīng)手術(shù)治療的難治性癲癎患者致癎灶標(biāo)本，以經(jīng)手術(shù)治療的非癲癎患者腦組織標(biāo)本做為對(duì)照，對(duì)臨床資料全面分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用光鏡、電鏡及凋亡細(xì)胞DNA原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察標(biāo)本中存在的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，對(duì)致癎灶神經(jīng)元和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)并加以比較。在第一階段實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)收集難治性

4、癲癎患者手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)用透射電鏡觀察神經(jīng)元線粒體形態(tài)。通過(guò)離心將腦組織標(biāo)本中線粒體與胞漿分離，隨后利用線粒體膜電位熒光探針和分光光度法分析線粒體膜電位，利用westernblot方法檢測(cè)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C和Caspase-3蛋白的含量，并進(jìn)行比較和半定量分析。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax的含量。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件完成。 結(jié)果:光鏡下致癎灶神經(jīng)元固縮、減少，反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生。用TUNEL方

5、法檢測(cè)，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞核呈棕色著染，陽(yáng)性細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞縮小，出現(xiàn)胞周間隙；對(duì)照組中神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)基本正常，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞罕見(jiàn)。難治性癲癎組神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯少于對(duì)照組；TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增高。電鏡下，癲癎組標(biāo)本中觀察到典型神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，染色質(zhì)濃縮，邊集于核膜，成境界清楚的塊狀，細(xì)胞核固縮，核仁消失，神經(jīng)元周圍樹(shù)突水腫，可見(jiàn)凋亡小體；神經(jīng)元線粒體普遍腫脹，特別在嵴的部位更為明顯，部分標(biāo)本可

6、見(jiàn)線粒體膜破壞；線粒體膜電位的比較發(fā)現(xiàn)，癲癎組熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，二者差異顯著；westernblot顯示胞漿Cyt-C和Caspase-3蛋白增多，與對(duì)照組存在顯著差異；免疫組化染色顯示，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞呈棕黃色著染，染色主要位于胞漿，與對(duì)照組比較，癲癎組Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多。 結(jié)論: (1)難治性癲癎患者致癎灶存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，神經(jīng)元凋亡可能參與癲癎的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程；