利用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞及轉(zhuǎn)分化技術(shù)建立癲癎疾病模型的研究.pdf

1、【研究背景】
　　在分化的體細(xì)胞中過表達特定的轉(zhuǎn)錄因子可將其重編程為多能性干細(xì)胞。通過這種方法建立的病人特異性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell,iPS),避免了移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng),且繞開了胚胎干細(xì)胞因破壞胚胎所帶來的倫理學(xué)問題。轉(zhuǎn)分化可將一種終末分化細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為另一種終末分化細(xì)胞,通過在體細(xì)胞中強制性表達外源基因可將其直接轉(zhuǎn)化為包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞類型。
　　嬰兒期嚴(yán)重肌陣攣性癲癎(

2、SMEI,也被稱為Dravet綜合征)和全面性(遺傳性)癲癎伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)兩者都可以由SCN1A基因的突變引起,該基因編碼NaV1.1電壓門控鈉通道的α1亞基。GEFS+的疾病頻譜包括了輕度至重度一系列的表型,其中最嚴(yán)重的表現(xiàn)是嚴(yán)重高熱驚厥綜合征,即Dravet綜合癥(也稱SMEI)。目前對于SMEI確切的致病機理尚不清楚,且沒有有效治療藥物。此外,一些常規(guī)抗癲癎藥物的使用還可導(dǎo)致其病情加重。
　　【研究目的】

3、r>　　通過iPS技術(shù)及轉(zhuǎn)分化技術(shù)對Dravet綜合癥患者進行體外建模,初步探討發(fā)病機理,并進行初步藥物篩選。
　　【材料與方法】
　　本研究通過兩種途徑將病人的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元:一是通過將病人的成纖維細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞,體外將其分化為成熟的神經(jīng)元;二是將病人的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為成熟的神經(jīng)元。
　　1.通過將OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入Dravet綜合癥及GEFS+病人

4、的成纖維細(xì)胞中,建立了30多株細(xì)胞系,并通過免疫熒光染色,核型分析,畸胎瘤實驗及芯片分析等鑒定其多能性。
　　2.將Dravet綜合癥,GEFS+病人及正常對照組hES體外定向分化為成熟的谷氨酰胺能及GABA能神經(jīng)元,并通過免疫熒光染色及電生理活動等方法進行鑒定。
　　3.通過在病人的成纖維細(xì)胞中過表達六種轉(zhuǎn)錄因子(ASCL1、BRN2、MYT1、NEUROD1、OLIG2和ZIC1)成功將其直接轉(zhuǎn)分化為谷氨酰胺能及GABA

5、能神經(jīng)元,并進行免疫熒光染色及Na通道活動等電生理檢測。
　　4.通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在體外分化的神經(jīng)元中,90％以上都是谷氨酰胺能神經(jīng)元,其余為GABA能神經(jīng)元;大部分轉(zhuǎn)分化的神經(jīng)元也都是谷氨酰胺能神經(jīng)元,少數(shù)為GABA能神經(jīng)元。
　　5.通過生物素(Biocytin)標(biāo)記電生理記錄過的神經(jīng)元,并通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),所記錄的神經(jīng)元都為谷氨酰胺能的神經(jīng)元。
　　【結(jié)果】
　　1.成功的建立了Dravet綜合癥

6、及GEFS+病人的iPS細(xì)胞系,通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)其可表達OCT4,SOX2,TRA-1-60?；チ鰧嶒灠l(fā)現(xiàn)Dravet綜合癥及GEFS+病人的iPS細(xì)胞形成的畸胎瘤可分化為三個胚層。核型檢測發(fā)現(xiàn)病人的iPS都具有正常核型?；蛐酒Y(jié)果分析發(fā)現(xiàn)病人的iPS細(xì)胞系基因表達與人類胚胎干細(xì)胞類似。
　　2.成功的將Dravet綜合癥及GEFS+病人的iPS細(xì)胞系體外定向分化為成熟的且有功能的谷氨酰胺能神經(jīng)元。這些神經(jīng)元可表達神經(jīng)元的

7、標(biāo)志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)其具有Na、K電流,動作電位及興奮性突觸后電流(mEPSC)。
　　3.通過檢測其Na通道活動發(fā)現(xiàn),Dravet綜合癥病人體外分化的神經(jīng)元Na電流變大,Na通道失活延遲,動作電位強度及頻率明顯增強,具有自發(fā)性癲癎樣放電及陣發(fā)性去極化偏移(PDS)。
　　4.通過將抗癲癇藥物苯妥英鈉處理Dravet綜合癥病人iPS體外分化神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),其N

8、a電流變小,動作電位強度及頻率減小,自發(fā)性陣發(fā)性去極化偏移現(xiàn)象消失,在一定程度上緩解其Na通道的過度興奮性。
　　5.成功的將Dravet綜合癥及GEFS+患者的成纖維細(xì)胞在體外直接轉(zhuǎn)分化為成熟的且有功能的神經(jīng)元,這種神經(jīng)元可表達神經(jīng)元的標(biāo)志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)其具有Na、K電流,動作電位。
　　6.通過電生理功能檢測發(fā)現(xiàn)Dravet綜合癥患者直接轉(zhuǎn)分化神經(jīng)元

9、,發(fā)現(xiàn)其Na通道失活延遲,這與iPS體外分化神經(jīng)元的病理表型相一致。
　　【結(jié)論】
　　1.建立了Dravet綜合癥及GEFS+病人的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞系,并將其定向分化為成熟且有功能的神經(jīng)元。
　　2.通過轉(zhuǎn)分化技術(shù)將Dravet綜合癥及GEFS+病人的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為成熟且有功能的神經(jīng)元。
　　3.利用iPS技術(shù)及轉(zhuǎn)分化技術(shù)建立了Dravet綜合癥及GEFS+疾病模型。
　　4.利用iPS體外分化的